Exista patru strategii generale folosite pentru donarea genelor patologice umane: (l)incepand cu cunoasterea si accesibilitatea proteinei, (2) folosind abilitatea selectarii conform functiei genei, (3)determinand localizarea genetica precisa (donarea pozitionala); si (4) cate combinatii ale informatiei referitoare la fenotip, localizarea pe harta genetica a genei respective si a genelor relente (o abordare pozitionala a genei candidate). Multe din primele succese ale donarii s-au bazat pe purificarea proteinei, determinarea secventei partiale a aminoacidului, prepararea anticorpilor si dezvoltarea examinarii enzimatice sau a altor tipuri de metode.Folosind toata aceasta informatie, clonele de ADNc au fost izolate utilizand abordari ca purificarea ARNm, screeningul pentru hibridizarea cu oligonucleotide, bazat pe secventa de aminoacid aflat la dispozitie, amplificarea prin reactia de polimerizare in lant, and la baza oligonucleotide similare, screeningul de tip imunologic al bibliotecilor informationale de expresii ale ADNc si alte abordari inrudite. in prezent, secventele de ADN exprimate pot fi deseori gasite in bazele de date, daca avem la dispozitie secventa minima de aminoacid. in anumite situatii, genele au fost donate pe baza unei proprietati functionale, fara a cunoaste proteina sau localizarea ei in cadrul hartii genetice. De exemplu, gene diferite implicate in tulburarile repararii ADN-ului au fost izolate, folosind selectia in cultura de tesuturi, pentru a identifica clonele ce corecteaza fenotipul celular al repararii ADN-ului defectiv.
Clonarea pozitionala reprezinta izolarea genei cauzatoare de boala, ce se bazeaza pe localizarea ei in genom, fara a cunoaste functia ei. Aceasta metoda este dependenta de analiza mostrelor de ADN de la familii afectate de boala, pentru a gasi un marker ADN localizat in vecinatatea locusului bolii, asa cum s-a discutat mai sus si ilustrat in . 65-l3.B . Localizand gena bolii, intr-un mod general, este posibila izolarea ADN-ului regiunii relente in clonele ce se suprapun, identificarea genelor din regiune si, in cele din urma, gasirea genei cauzatoare de boala, deseori prin identificarea de mutatii mici intr-una din gene (ura 65-l4). Aceasta metoda este imbunatatita daca sunt accesibile translocatii cromozomiale, pentru a ajuta la identificarea si intocmirea hartii genei implicate. Aceasta abordare a avut un succes remarcabil, asa cum s-a intamplat in identificarea genelor distrofiei musculare Duchenne, fibrozei chistice, retinoblastomului, polipozei colonului, bolii Huntington si cancerul de san (BRCA 1 si BRCA2).
Cu cat mai multe gene sunt descrise, abordarea genei candidate, din punct de vedere pozitional, a devenit foarte producti in identificarea genelor patologice. O astfel de strategie pura implica deducerea genei raspunzatoare de boala dintre proteinele cunoscute, bazandu-ne pe fenotipul bolii, dar, mai adesea, abordarea genei candidate necesita realizarea unei harti genetice aproximative, nu insa atat de des pe cat ar fi necesar pentru un efort de donare pozitionala. Bazandu-ne pe
informatia limitata data de intocmirea hartii, pe cunoasterea asezarii unor gene relente din aceeasi regiune si probabil luand in considerare informatia cunoscuta de la alte specii, cum ar fi soarecele, putem formula si testa ipoteza conform careia o gena particulara este supusa mutatiei intr-o boala specifica prin amplificarea si/sau clonarea genei respective de la pacientii afectati de boala, in cautarea mutatiilor. O astfel de abordare duce la identificarea mutatiilor de la nivelul genelor lanturilor grele de miozina din miocard, care cauzeaza cardiomio-patia hipertrofica familiala, in gena fibrilinei din sindromul Marf an, in protooncogena RET din neoplazia multipla endocrina tipul 2 si in riatele gene de reparare a ADN-ului din cancerul de
colon fara polipoza ereditara. Folosirea informatiei obtinute de la soarece a dus la recunoasterea faptului ca gena PAX3 sufera o mutatie in sindromul Waardenburg. O riatie in abordarea genei candidate implica producerea de soareci cu mutatii tintite si identificarea genelor candidate, tinand cont de fenotipurile soarecilor, care se aseamana cu fenotipul uman. Localizarea pe harta genetica a multor stari patologice este ilustrata in ura 65-l5, majoritatea acestor gene fiind donate.
