Provocarea de a detecta mutatii necunoscute este diferita de testarea in scop diagnostic a mutatiilor cunoscute. Mutatiile mari sunt mult mai usor detectate prin metoda de marcare Southern sau reactia de polimerizare in lant pentru detectarea tripletelor extinse ce se repeta, deletiilor, insertiilor, si a altor rearanjamente. RT-PCR se foloseste pentru a detecta absenta sau reducerea majora a ARNm, determinata de alele mutante; in primul rind, polimorfismul comun este folosit pentru identificarea heterozigo-tismului de la nilul unui exon al ADN-ului genomic, urmat de analiza ratiei ARNm a celei de a doua alele. Aceasta strategie va detecta orice mutatie ce reduce serios nilul ARNm. Metode mai discriminati sunt necesare pentru detectarea mutatiilor punctiforme. Metodele cel mai bine caracterizate necesare detectarii mutatiilor necunoscute sunt: clivarea ribonucleazei, electroforeza de denaturare pe gradient-gel, modificarea carbodiimid
ei, clivarea chimica a legaturilor gresite, analiza polimorfismului conformatiei unicatenare, analiza heterodu-plexului si analiza secntei de ADN (ura 65-9). Aceste metode implica recunoasterea chimica sau enzimatica a legaturilor gresite in duplexele de acid nucleic, separarea electroforetica a lanturilor uni- sau dublucatenare de ADN sau analiza secntelor ADN-ului. Aceasta ultima metoda poate fi realizata direct pe produsele obtinute din reactia de polimerizare in lant sau din clone individuale sau grupuri de clone. Sensibilitatea detectarii mutatiilor variaza de la 80 la virtual 100 procente, iar analiza poate fi realizata pe ADN-ul genomic sau ARNm (ADNc), depinzand de circumstantele speci
fice. PTT detecteaza un subset de mutatii, in primul rand cele nonsens si cele de modificare a structurii. in cazul mutatiilor chi distribuite larg in populatie, metodele diagnostice se concentreaza pe prezenta sau absenta mutatiilor particulare. Aceste metode includ hibridizarea ASO, amplificarea alele-specifica, amplificarea sau estimarea ligazei de secntializare a extensiei primerului si analiza enzimei de restrictie (incluzand introducerea artificiala de zone de restrictie; ura 65-9). Toate aceste metode depind de hibridizarea sau de reactia enzimatica necesara diferentierii secntelor de acid nucleic ce difera chiar si numai printr-o singura baza.
