Strategia triplu-helix vizeaza ADN-ul genomic. Scopul oligonucleotidelor TFO (,Jriple-helix-forming oligonucleotide"), denumite si "oligonucleotide antigena", este de a interfera cu procesul de transcriere a genei. Se intervine, deci, la o etapa si mai precoce din fluxul de transmitere a informatiei genetice de la ADN la proteina.
Formarea triplului-helix se bazeaza pe capacitatea bazelor purinice ale ADN-ului de a forma legaturi de hidrogen suplimentare (re . 6.1). in . 8.1 sunt indicate cate dintre modurile de "recunoastere" de catre bazele unui al treilea lant (denumit "lant Hoogsteeri\'\'\') a perechilor de baze ,Watson-CriclC ale ADN-ului dublu-elicoidal.
Cuprins:
Principii de bază |
sus  |
Prima constatare este aceea că suntem limitaţi de faptul că secvenţa ţintită pe genă trebuie să conţină numai purine. Fără să intru în amănunte, precizez că, în funcţie de secvenţa vizată, pot fi privilegiate:
- (i). legăturile zise Hoogsteen directe (rândul de sus), când "polaritatea" celui de-al treilea lanţ (parcurgerea lanţului polinucleotidic în sensul 5\'->3\') coincide cu cea a lanţului conţinând purinele din dublul-helix de ADN, sau
- (ii), legăturile Hoogsteen inverse, cănd lanţul Hoogsteen şi lanţul conţinând purinele sunt antiparalele (rândul de jos).
Ceea ce trebuie reţinut este că un "tract polipurinic" poate fi "atacat" cu un oligonucleotid conţinând fie guanine (G) şi adenine (A), fie guanine şi timine (T).
în principiu, după identificarea ţintei adecvate în gena pe care dorim s-o inhibăm, urmează a se alege secvenţa oligonucleotidului în funcţie de tipul de intercaţiune preconizat. Aici e toată arta. Prin experienţe preliminare de inhibare prin strategie triplu-helix a proliferării în celule în cultură a virusului Friend, asociat cu eritroleucemia murină, am demonstrat că metoda dă roade:
- Am dedus (măsurând temperaturile critice de termoeluare) că triplu-helixurile formate cu oligonucleotide conţinând G şi A sunt mai stabile decât cele conţinând G şi T şi am conchis că tractul vizat trebuie să depăşească o anumită lungime.
- Am mai decis că, pentru a câştiga în eficacitate, administrarea oligonucleotidelor trebuie sa se facă pe cale vectorizată şi am optat pentru utilizarea lipozomilor.
Lipozomii
Lipozomii sunt vezicule lipidice uni- sau multi-lamelare, generate spontan prin tendinţa moleculelor amfifile (cap polar şi lanţ alifatic) de a se asocia în membrane. Lipozomii cationici (de tipul lipofectinei, pe care am utilizat-o noi) sunt ca nişte sfere încărcate pozitiv, de dimensiuni sub-celulare. Oligonucleotidele, ca orice moleculă de ADN, sunt încărcate negativ, datorită ionizării grupelor fosfat ale catenelor. Ele se "lipesc" pe lipozom prin atracţie electrostatică. Complexului lipozom-oligonucleotid îi mai rămâne un exces de sarcină pozitivă pentru a fi atras către membrana celulară, încărcată negativ (datorită fosfolipidelor), căreia îi "livrează" oligonucleotidul transportat. Ajuns în celulă, el "identifică" şi blochează fie ARN-ul mesager de secvenţă complementară, dacă este vorba de un oligonucleotid antisens, fie tractul polipurinic al unei gene, dacă este un oligonucleotid destinat a forma un triplu-helix.
Precizez ca o curiozitate faptul că încă NU s-a reuşit să se incorporeze cu randament convenabil medicamente sau alţi produşi (cosmetici, de pildă) în interiorul lipozomilor. In cremele de faţă, zise cu lipozomi, aceştia din urmă nu transportă decât... apă! E drept că şi să dai celulelor să bea le face bine...
Am aplicat toată experienţa astfel câştigată la conceperea unui oligonucleotid care să blocheze promotorul oncogenei umane HER2 (sau c-ErbB-2), care este adesea supra-exprimată în numeroase canceruri, în special în cancerul de sân. Să abordăm mai în detaliu această boală.
Cancerul de sân |
sus |
Factorii genetici
Apariţia cancerului de sân este legată de prezenţa unor factori genetici (a se înţelege "genici", la nivel de gene), implicând: oncogenele (unele dintre ele fiind amplificate sau supraexprimate, iar altele fiind mutante), genele supresoare de tumori şi cele implicate în repararea erorilor de replicare a ADN-ului.
. Printre oncogenele amplificate (prin dedublare a genei, în urma unei recombinări aberante) se numără cel mai adesea gena c-ErbB-2 (HER2). Din contră, este adesea "supraexprimatâ" transcripţional gena c-Myc. Termenul "supraexprimare" este adesea înşelător. De exemplu, gena int-2, din vecinătatea lui c-Myc, poate fi amplificată iar efectul activator se răsfrânge şi asupra acesteia din urmă.
. Printre genele mutante se numără adesea gena Ras. Muaţiile sunt punctiforme şi afectează mereu aceiaşi codoni (12, 13 şi 61), dar apar tardiv în evoluţia tumorii. Chiar şi când se constată o supra-exprimare a unei variante Ras non-mutante, ea este datorată tot unor mutaţii, de data asta în zonele de reglare şi control ale genei. De exemplu, zona repetitivă ("minisatelif\') situată în aval de Ha-Ras are funcţie de stimulator transcripţional ("enhance?\'\') atunci când suferă o mutaţie.
. Genele supresoare de tumori asociate cu cancerul de sân sunt BRCA1 şi BRCA2. Funcţiile lor sunt în curs de precizare. Prima codifică o proteină de 1863 aminoacizi care ar avea capacitatea să interacţioneze cu ADN-uI. Cea de-a doua (care, în afara numelui, nu are nici o omologie cu prima) codifică o proteină de 3418 aminoacizi. Inactivarea lor prin mutaţii punctiforme, transmise pe cale ereditară, este răspunzătoare de predispoziţia spre acest tip de cancer. De remarcat că există mutaţii somatice, la nivelul altor oncogene, localizate în vecinătatea lui BRCA1, care par a fi răspunzătoare de cancerul de sân sporadic (nejustificat ereditar). In plus, se crede că mai există şi alte "gene ale cancerului de sân", din familia celor supresoare de tumori, care ar fi implicate în cancerul de sân la bărbat.
. în ceea ce privesc erorile de replicare ale ADN-ului, acestea se datoresc fie unor mutaţii la nivelul genelor care codifică proteinele implicate în repararea ADN-ului, fie datorată instabilităţii cromozomiale, manifestată în primul rând la nivelul secvenţelor "microsatelit". Se crede chiar că identificarea unei asemenea instabilităţi, care se manifestează în primele faze ale bolii, ar putea deveni o metodă de identificare precoce a orientării spre cancer.
ADN-ul satelit
E momentul să deschidem o nouă paranteză.
ADN-ul unei celule poate fi divizat în câteva categorii: ADN-ul primar (adică genele), care codifică proteine, secvenţele de ADN implicate în modularea expresiei genice (de pildă promotorii), "gene" care codifică ARN (ribozomal, de transfer) şi ADN repetitiv. ADN-ul repetitiv este de două feluri: transpozonii şi ADN-ul satelit.
. Transpozonii sunt secvenţe scurte de ADN parazitar, care, la fel ca retroviruşii, au capacitatea de a fi transcrise, excizate şi re-integrate în altă parte a genomului. Unii transpozoni codifică o transpozază, enzimă similară în multe privinţe integrazei virusului HTV-1! Evident, integrându-se în promotorul sau în secvenţa codantă a unei (onco)gene, transpozonii pot deregla sau compromite funcţionarea acesteia.
. Denumirea de "satelit", dată unor secvenţe repetitive din ADN, provine dintr-o experienţă de fracţionare a ADN-ului fragmentat, extras de la musculiţa de experienţă Drosophila melanogaster prin ultracentrifugare în gradient de clorură de cesiu. Acest gradient permite separarea de fracţiuni în funcţie de densitatea lor şi, deoarece o pereche de baze G-C este mai densă decât una A-T, fragmentele de ADN recuperate s-au distribuit într-o bandă majoră, de densitate medie, acompaniată de câteva benzi minore, de densităţi respectiv mai mari şi mai mici, care au primit denumirea de sateliţi.
S-a constatat ulterior că (excepţie făcând ADN-ul aparţinând diferitelor organite celulare) ADN-ul satelitar din toate speciile posedă secvenţe repetitive (denumite jandem"), că acestea sunt adesea situate în regiunile din preajma centromerilor sau a telomerilor (adesea vizibile la microscop) şi că nu sunt niciodată transcrise. Există şi secvenţe repetitive a căror densitate se nimereşte a fi egală cu cea a majorităţii ADN-ului. Mai există şi alte secvenţe, zise "moderat repetitive", aparţinând unor gene prezente în copii multiple, pentru că transcrierea lor este intens solicitată. E cazul, de pildă, al genelor care codifică ARN-ul ribozomal, tubulina şi histonele, despre care n-am pomenit decât în treacăt în paginile precedente.
Genomul uman posedă 5 sateliţi majori, dintre care primii patru conţin secvenţe repetate, lungi de mai puţin de 100 perechi de baze, care reprezintă variaţii pe tema GGAAT, iar al cincilea, de 171 perechi de baze (prezent atât la om cât şi la maimuţe) este bogat în A şi T. Numărul celorlalte secvenţe repetitive, prezente la un anumit locus, variază de la un individ la altul.
Cu titlul de curiozitate, e de reţinut faptul că există astfel de secvenţe (denumite VNTR, "variable number of tandem repeats") care sunt prezente în câte un singur locus per genom. Poziţia acestora, care variază de la un caz la altul, permite identificarea indivizilor prin faimoasele teste ADN.
Roiul precis al sateliţilor începe abia a fi descifrat. Lungimea unei secvenţe repetitive poate afecta frecvenţa transcrierii genelor adiacente. E cazul, de pildă, în diabet, unde o anumită secvenţă satelit de pe cromozomul 6 e repetată de abia 40 de ori în loc de 140 la omul sănătos.
ADN-ul satelit ne conduce la abordarea unui alt domeniu conex al oncologiei moleculare: metilarea ADN-ului.
Metilarea adn-ului |
sus |
Nu toate genele unei celule se exprimă tot timpul şi, dintre cele două gene presupuse identice, prezente pe cei doi cromozomi, nu se exprimă, de regulă, decât una dintre ele! Dacă pentru modularea expresiei genice există o serie de proteine (factori nucleari) care interacţionează direct cu ADN-ul, celulele mai dispun de un mod suplimentar, extrem de rafinat, de a controla ansambluri de gene, constând în metilarea specifică a unor citozine din secvenţa de ADN.
Organismele unicelulare nu recurg decât rareori la metilare, deşi există execepţii notabile. De pildă, la unele bacterii, grupele metil, dispuse în mod savant în lungul genomului. indică celulelor că e vorba de ADN-ul propriu, spre a-l diferenţia de cel al unor eventuali viruşi, pe care îl vor distruge graţie unui sistem imunitar primitiv.
în organismele pluriceiulare, în speţă la mamifere, metilarea pare a juca două roluri distincte: fie că afectează interacţiunea factorilor nucleari cu ADN-ul, fie că determină gradul de compactare a înfăşurării acestuia.
In ambele cazuri, prezenţa grupei metil afectează structura locală a ADN-ului. Genele, inclusiv cele care veghează la diviziunea celulară, sunt adesea inactivate prin metilarea promotorilor lor, cu consecinţe clare în cancer. Este cazul, de pildă, al inactivării prin metilare a promotorului genei proteinei retinobia^bmului^ cunoscută şi sub numele pi6 sau iNK4a. Vom mai reveni asupra aspectelor structurale legate de metilare.
Metilarea incorectă a ADN-ului poate fi sursa unor boli. Dacă pentru anumite gene este, probabil, indiferent dacă cea care se exprimă aparţine cromozomului de provenienţă matemală sau celui de provenienţă paternală, există afecţiuni la noul născut datorate faptului că ambele gene sunt exprimate simultan. Cauza o constituie metilarea neortodoxă a ADN-ului.
Recent a fost descris primul sindrom genetic uman cauzat de metilarea defectuoasă a ADN-ului. Este vorba de sindromul ICF {,Jmmunodeficiency, Centromere instability and Facial anomalies"): metilarea insuficientă a anumitor zone din ADN produce cromozomi instabili, care se fragmentează uşor şi se rearanjează greşit în mitoză. Mai mult decât atât, s-a arătat că "amuţirea" unor gene ar putea fi realizată prin metilarea secvenţelor satelit (repetitive) din proximitatea acestora şi nu a genelor însăşi.
Metilarea secvenţelor cre/tre |
sus |
Celulele normale, menţinute în cultură, nu se divid decât dacă sunt stimulate de prezenţa în mediu a câtorva "factori de creştere", de felul lui PDGF (,j)latelet-derived growth factor", produs al genei Sis), sau EGF ("epidermal growth factof). Factorul de creştere se fixează pe un receptor membranar, de pildă o proteină din familia ErbB, despre care vom discuta mai jos. Fixarea ligandului (factorului de creştere) pe receptor declanşează o cascadă de evenimente de semnalizare în citosol. Cel mai adesea, participanţii la această serie de evenimente sunt nişte protein-kinaze, de exemplu produse ale genelor Src, Ras, AH, inclusiv a genei de fuziune Bcr/Abl, despre care am pomenit deja. In general, fosforilarea proteinelor duce la activarea lor şi la transmiterea semnalului, din aproape în aproape, până la nucleu. în nucleu are loc fosforilarea unor "factori de transcriere" (sau "factori nucleari"), care se fixează pe ADN în zonele de "promotor" sau de "enhancer" ale anumitor gene, declanşând transcrierea acestora. Din categoria factorilor nucleari fac parte proteinele produse de genele Jun, Fos, sau de analogii acestora, Mqf, Atf, CREB.
Dintre genele astfel puse în mişcare, unele codifică la rândul lor alţi factori de transcriere. Este cazul, de pildă, al genei Myc, Genele a căror transcriere este indusă în continuare ar putea să codifice, de pildă, cicline, implicate în orientarea celulei în direcţia mitozei. Celulele canceroase sunt celule lansate în mitoză nejustificată. Toate genele înscrise cu caractere cursive în acest paragraf sun protooncogene. Ele pot deveni oncogene dacă suferă mutaţii în secvenţa codantă (astfel încât produsul lor se menţine activ în mod constitutiv, adică şi în lipsa unui semnal pozitiv), sau dacă suferă mutaţii în secvenţa propriilor promotori sau enhanceri (astfel încât proteinele corespunzătoare sunt generate în exces). Toate aceste mutaţii sunt dominante, adică e suficient ca una dintre cele două gene de care dispune celula să fie modifictă, pentru ca efectul oncogenic să se manifesteze. Simpla diviziune necontrolată a celulelor nu este încă sinonimă cu cancerul. Celulele care se divid sunt, însă, supuse riscului suplimentar de a achiziţiona noi mutaţii. Aşa se face că, în cadrul viitoarei tumori, se dezvoltă clonuri de celule cu un număr din ce în ce mai mare de oncogene mutante. Orientarea spre mitoză nu este, însă, apanajul exclusiv al mutaţiilor. Metilarea diferenţiată a unor secvenţe din ADN poate juca un rol subtil în acest sens. Redau mai jos un exemplu derivat din experienţa propriului nostru laborator.
Direcţionarea diferită a unor factori nucleari prin metilarea diferenţiată a unor promotori e ilustrată în cazul secvenţelor CRE (,Łyclk-AMP-bmding element", elementul ce răspunde la cAMP) şi TRE (nTPA responsive element, elementul ce răspunde la TPA, un ester de forbol). Secvenţa lanţurilor dublului-helix e indicată în Fig. 8.2. Se va observa, de altfel, că secvenţa CRE este autocomplementară şi invers-repetitivă, ea este un palindrom: se citeşte la fel pe un lanţ de la stânga apre dreapta ca şi pe celălalt de la dreapta spre stânga.
Secvenţele CRE şi TRE sunt recunoscute de către factori de transriere din familia de proteine "b-zip". Acestea sunt dimeri (sau heterodimeri), care "cuprind" dublul-helix de ADN ca într-o furcă (vezi Fig. 8.2, dreapta). Unul dintre braţele furcii recunoaşte o ramură a palindromului, iar celălalt se aplică pe cea de-a doua
Noi am studiat prin RMN detaliile moleculare (structura fină a ADN-ului) care stau la baza recunoaşterii diferenţiate de către proteine a acestor secvenţe, dintre care a doua (TRE) diferă faţă de prima (CRE) prin lipsa unei singure perechi de baze. Evident, dacă în centrul palindromului TRE lipseşte o pereche de baze, cele două ramuri ale acestuia nu vor mai fi găsite de către furca dimerului b-zip în aceeaşi orientare ca în cazul lui CRE.
Cele două secvenţe sunt situate în promotorii a două categorii de gene. Prima, care reacţionează, între altele, la stimularea prin AMP ciclic (cAMP) a unui factor nuclear denumit CREB ("cyclic AMP-binding proteaf), reprezintă gene de răspuns la evenimente "curente". A doua, care reacţionează la stimularea protein kinazei C. sunt implicate în declanşarea mitozei, a unor procese legate de creşterea celulară şi compoziţia matricii extracelulare, procese care pot conduce la cancer.
Am menţionat deja faptul că secvenţa CRE permite, de exemplu, fixarea factorului nuclear Jun sub forma unui homodimer Jun/Jun. Noi am arătat că metilarea citozinei "pasului" central, CpG din CRE schimbă conformaţia locală şi flexibilitatea întregii secvenţe, ceea ce face ca homodimerul Jun/Jun să nu mai aibă unde se ataşa. Excesul de Jun, devenit liber, conduce la formarea de heterodimeri de felul lui Jun/Fos. Acest heterodimer se fixează, însă, pe secvenţa TRE. Iată, deci, că metilarea promotorului unor gene "cuminţi" dirijează factorii nucleari spre abordarea unor gene implicate în cancer.
Alterări epigenetic prin metiiare |
sus |
Majoritatea zdrobitoare a oncogenelor intră în acţiune atunci când secvenţa lor de ADN suferă o mutaţie. Proteina mutantă astfel rezultată devine răspunzătoare de multiplicarea necontroiată a celulelor şi de celelalte schimbări funcţionale asociate cu cancerul. Am văzut mai sus că nu numai genele "mutante" sunt răspunzătoare de cancer. E suficient, pentru aceasta, ca ADN-ul să fie modificat chimic, fără a-i altera însă, secvenţa. O astfel de modificare se numeşte "epigenetică".
După cum am menţionat, (hiper)metilarea ADN-ului împiedică, în general, activarea transcripţiei genei. In general, genomul celulelor canceroase este hipometilat, cu excepţia, însă, a promotorilor unor antioncogene, care, dimpotrivă, sunt hipermetilaţi şi, deci, "scoşi din circulaţie". Cum se realizează această "selecţie"? lată un exemplu.
O proteină oncogenică, (PML-RAR), implicată în dezvoltarea leucemiei acute promielocitice (APL), acţionează prin aceea că recrutează două enzime (metilaze) capabile să implanteze grupe metil pe bazele acidului nucleic la un locus specific, promotorul genei supresoare de tumori RARP (gena pentru varianta p a receptorului acidului retinoic), inducând "adormirea" acesteia.
Rezultatul este că celulele rămân imature, în stadiul în care se divid la nesfârşit, caracteristic leucemiei. Specificitatea pentru acest locus e dată de prezenţa proteinei de fuzionare (PML-RAR), rezultată prin accidentul genetic în urma căruia gena care codifică varainta a a receptorului pentru acidul retinoic (RARa) a fuzionat cu gena aşa-zisei proteine a leucemiei promielocitice (PML). în mod normal, complexul format de acidul retinoic cu receptorul său (RAR) controlează exprimarea genelor în aşa fel încât globulele albe trec din faza imatură la cea de maturitate. Proteina de fuzionare are efectul opus, dar în mod indirect, acţionând în sensul inactivării prin metilare a genei RARp.
Culmea, starea de imaturitate, odată ce a fost impusă, se menţine şi în lipsa proteinei de fuzionare! Agenţi de felul acidului retinoic, sau al 5-Aza-deoxicitidinei (5-Aza-dC) restabilesc comportamentul normal al celulelor, primul, pentru că în prezenţa excesului de acid retinoic proteina de fuzionare PML-RAR se comportă ca şi proteina normală RAR, iar al doilea, pentru că "recupereză" grupele metil de la acidul nucleic. Dezvoltarea de medicamente capabile să împiedice metilarea genelor este una dintre direcţiile prin care se caută noi terapii ale cancerului.
După acest detur pe la ADN-ul satelit şi metilare, să revenim acum la cancerul de sân.
Supraexprimarea genei her2 în cancerul de sân |
sus |
Oncogena umană ErbB-2 este supraexprimată în 25% de cazuri de cancer de sân, precum şi în numeroase cancere gastrice, de colon şi de prostată. Ea codifică un receptor transmembranar dotat cu activitate tirozin-kinază. Proteina prezintă un înalt grad de omologie cu receptorul EGF {^epiderma! growth factor"), care este produsul genei ErbB-1. Celulele tumorale care supraexprimă receptorul ErbB-2 sunt mai "agresive": ele devin hormonoindependente (independente de estradiol şi, deci, rezistente ia taxol!), câştigă capacitatea de a metastaza şi de a-şi stimula propria lor vascularizare. Interesul de a stăpâni această genă este evident în fond, este prima oncogena vizată prin terapie moleculară: prin strategia triplu-helix, în cazul descris în continuare, iar mai apoi prin strategie imunitară, în varianta ,jKrceptin,\\ adoptată comercial.
Familia de receptori ai factorului de creştere epidermic, EGF, conţine 4 receptori de tip tirozin-kinază, denumiţi de la ErbB-1, până la ErbB-4, sau de la HER1 Ia HER4 (HER ar putea însemna ,Jiuman epidermal growth factor receptor\'\'\'). După cum am văzut deja, activarea acestor receptori presupune dimerizarea, sub influenţa ligandului, a două molecule din aceeaşi familie.
Numărul de combinaţii posibile, realizate cu cele patru elemente, este însemnat Se cunosc cel puţin 8 hormoni care mediază dimerizarea, între aceştia numărându-se EGF şi heregulina. Nu există (deocamdată) un ligand specific doar pentru HER2, în schimb heregulina pare a favoriza dimerii de tipul HER2:HER3 sau HER2:HER4. Se pare că supraexprimarea genei c-ErbB-2 conduce, prin interacţiune directă între proteinele respective, la activarea tirozin-kinazei c-Src. Deasemenea, sunt afectate căile de semnalizare în care sunt implicate proteinele Ras şi Raf. Creşterea activităţii Ras este urmată de fosforilarea unor proteine, precum Ets, AP-1 şi NFkB, care conduce, în continuare, la activarea transcripţională a unor gene Ets-, AP-1-, sau NFkB- dependente. (De remarcat că promotorul genei ErbB-2 are şi el un locus ("s/te") Ets, ceea ce ilustrează complexitatea interacţiunilor). Rezultatul este că apar noi trăsături fenotipice. De exemplu, activarea transcripţională a genei urokinazei permite proteoliza matricii extracelulare, care este esenţială în vederea progresiei tumorii.
Se mai constată că supraexprimarea lui ErbB-2 duce la inhibarea unor promotori, în speţă cel pentru factorul nuclear SP-1. Prin modularea negativă a genei integrinei-a2, cauzată de faptul că SP-1 nu-i mai poate activa transcrierea, urmează destrămarea întregii arhitecturi a ţesutului unde e localizată tumoarea. Se mai observă o reducere a duratei de viaţă a proteinei p53, cu consecinţe pe care acum le putem anticipa. Aceasta nu împiedică faptul ca pe parcurs, să se selecţioneze în cadrul tumorii acele celule în care p53 este mutantă şi complet inactivă. De remarcat că, prin absenţa proteinei p53, celulele tumorale capătă abilitatea de a creşte şi în condiţiile de hipoxie datorate slabei vascularizaţii, condiţii în care în mod normal ar trebui să recurgă la apoptoză.
Ţinta moleculară pentru formarea unui triplu-helix care să blocheze transcrierea lui HER2
In Fig. 8.3 e reprezentată o parte din secvenţa promotorului genei HER2. Am indicat doar unul dintre cele două lanţuri ale dublului-helix (lanţul "Cricl?\\ sau ,,+"), porţiunea de 28 baze, vizată de oligonucleotid, fiind subliniată. Se remarcă faptul că zona aleasă de oligonucleotid drept ţintă este "în amont" de secveţa "TATA-box", unde va avea loc iniţierea transcrierii şi "în aval" de o altă secvenţă cu rol de fixare a unui factor nuclear, elementul CCAAT. Ambele sunt marcate cu caractere îngroşate.
Fig. 8.3
Promotorul:
5-GCTCCCAATCAC-
-AGGAGAAGGAGGAGG7GGAGGAGGAGGG-
-CTGCTTGAGGAAGTATAAGA-3.
Oligonucleotidul: 3,AGGAGAAGGAGGAGGCGGAGGAGGAGGG-5,
Secvenţa de baze purinice ţintită este întreruptă de o pirimidină, T (indicată în caracter cursiv), pentru care nu există regulă de împerechere. Pentru a identifica baza (dintre cele patru disponibile, A,C,G,T) care să fie introdusă în oligonucleotid la acel nivel am recurs la modelizarea moleculară pe calculator. Calculele au arătat că o citozină (C) permitea realizarea unui triplu-helix regulat (Fig. 8.4, stânga), în timp ce o timină, de pildă, producea o îngrămădire sterică (o deformare) importantă (marcată cu o săgeată în Fig. 8.4, dreapta).
în ambele situaţii, baza din lanţul al treilea realizează cu baza purinică din perechea Watson-Crick o legătură de hidrogen şi totuşi diferenţa de stabilitate (de energie) între cele două structuri, de minimă şi maximă energie, este importantă, de ordinul a 100 kcal/mol. (Cu titlu de comparaţie, energia unei legături de hidrogen este mai mică cu un ordin de mărime). Ceea ce este şi mai interesant este faptul că efectul distorsiunii, deşi locală, pare a se propaga şi afecta stabilitatea întregului triplu-helix.
Urmează o serie de detalii structurale şi de chimie-fizică legate de formarea triplului helix, destinate specialiştilor:
- Modelizarea moleculară a fost combinată cu spectroscopia cu transformată Fourier în domeniul infraroşu, care, prin benzile de absorpţie, revelează "semnături" ale diverselor grupe care interacţionează. S-a confirmat faptul că restul triplului-helix este realizat prin triplete de tipul G(GC) şi A(AT) revers-Hoogsteen, cu bazele în orientare anii şi dezoxiribozele în conformaţie Sud, ca şi în ADN-ul canonic de formă B.
- Prin titrare eiectroforetică, s-a obţinut constanta de disociere a oligonucleotidului, egală cu 80 nM (nM: "nanomolar"= 10 9 M). Altfel spus (cel puţin în condiţiile utilizate in vitro), concentraţia oligonucleotidului trebuie să depăşească 80 nM pentru ca triplul helix să se formeze. De remarcat că majoritatea medicamentelor uzuale au constante de disociere de ordinul micromolarului (10"6 M), deci le trebuiesc asigurate concentraţii mult mai mari ca cea solicitată de oligonucleotid.
Un alt parametru important este durata de viaţă a oligonucleotidului în interiorul celulei. După ce l-am administrat cu ajutorul lipofectinei în cultura de celule MCF7 (celule derivate dintr-un cancer de sân), l-am putut recupera ne-degradat câteva zile mai târziu, în ciuda faptului că celulele se şi divizaseră între timp.
Prin microscopie confocală şi dublu marcaj fluorescent (lipozomul, cu rodamină, care emite culoarea roşie, oligonucleotidul, cu fluoresceină, care se vede verde) am putut urmări modul în care, foarte rapid, complexul penetrează în celulă, se desface în cele două componente, urmând ca oligonucleotidul să se dirijeze spre nucleu, iar lipidele constituente ale lipozomilor să fie eliminate spre periferia celulei pe parcursul a câtorva zile.
Am inhibat, oare, transcrierea genei HER2? Scăderea nivelului de ARN mesager corespunzător, care începe la câteva ore de la administrarea oligonucleotidului, e compatibilă cu inhibarea transcrierii Am măsurat nivelul de ARN printr-o tehnică de hibridizare cu o sondă radioactivă (tehnica Northern blof\'). In Fig. 8.5 am exprimat nivelul de ARNm corespunzător genei HER2 în două moduri diferite: raportat la ARN-ul total şi raportat la ARN-ul mesager al unei gene-martor, cea a proteinei GAPDH.
Concordanţa dintre cele două rezultate arată, între altele, că transcrierea genei GAPDH nu a fost afectată de oligonucleotid. Inhibarea genei HER2 este, deci, selectivă.
Tehnica Northern nu ne permite să ştim cu ce randament am mhibitat gena (poate chiar 100%), căci se pare că celulele deţin o rezervă (,pooF) de ARNm, protejat împotriva degradării, pentru "intrevenţii de urgenţă", pe care sonda radioactivă o identifică. Din figura de mai sus reiese însă clar un lucru neaşteptat: după o perioadă de inhibiţie, celulele "intră în panică", îşi găsesc noi resurse şi urmează o recuperare brutală a nivelului de ARNm, care depăşeşte, chiar, nivelul anterior.
Nivelul proteinei HER2, măsurat printr-o tehnică imunologică (ELISA, ,Łnzyme-lînked immuno aisay") urmează o evoluţie similară Trebuie spus că nivelul receptorului ErbB-1, măsurat în paralel, nu a suferit nici o modificare, ceea ce subliniază din nou selectivitatea oligonucleotidului, adică faptul că nu afectează şi alte ţinte.
Nivelul proteinei HER2 scade în primele ore, după care celulele, intrate în panică, produc mai mult decât Ia început. Se vede însă bine că nivelul receptorului HER2 este intens reglementat: după episodul de panică, celula tinde a readuce expresia acestei oncoproteine la nivelul care îi era pre-slabilit
Oligonucleotide de secvenţă uşor modificată nu au avut nici un efect inhibitor asupra nivelului proteinei HER2, confirmând faptul
că oligonucleotidul dirijat contra genei HER2 a fost specific pentru secvenţa ţintită.
Modularea expresiei genei HER2 a confirmat potenţialul strategiei triplu-helix, ne-a confirmat faptul că nivelul de exprimare a unor oncogene este puternic reglementat şi ne-a dat o idee a scalei de timp Ia care se produc procesele moleculare legate de transformarea oncogenică.
Pentru motive încă ne-elucidate, modularea expresiei genei HER2 a fost temporară. Poate că administrarea repetată a oligonucleotidului ar fi transformat efectul temporar într-unui permanent. Nu am continuat, însă, aprofundarea problemei, ci m-am ocupat, un timp, de vizarea altei gene, TNFa, despre care voi pomeni ceva mai încolo.
Exploatarea, însă, a "obiectivului" HER2 a continuat în numeroase laboratoare şi la alte niveluri decât cel al transcripţiei genei. De pildă, anticorpii recombinând umani, care recunosc în domeniul extracelular al proteinei HER2 epitopul Mab4D5, vor fi comercializaţi sub denumirea herceptin. Se va vorbi mult despre ei în anii ce vin. Ei constituie primul medicament destinat terapiei cancerului prin vizarea specifică a produsului unei oncogene.
Alte strategii implicând oligonucleotidele Strategia "leurre" ("decoy")
Dacă am fost implicat un timp în strategia "păcălelii" (în franceză, leurre, în engleză, decoy), a fost doar pentru că laboratorul nostru a dorit să se convingă de faptul că ceea ce părea intelectualmente realizabil se confirma în practică. în acest sens, am sintetizat fragmentul de ADN dublu-helix care reprezenta locusul de fixare al factorului nuclear NFkB în promotorul unor gene (inclusiv al virusului H1V-1) şi am constatat că, dintr-un extract celular, aceste fragmente "colectau" toate proteinele NFkB. E posibil, deci, să dirijezi anumiţi factori proteici spre ţinte false, reprezentate de secvenţe sintetice, introduse în celulă în exces faţă de cele câteva ţinte reale, situate pe ADN-ul genomic, deturnându-i astfel de la funcţionalitatea lor obişnuită.
Numărul de situaţii în care strategia decoy a fost întrebuinţată în scopuri de "terapie genică" creşte neîncetat De pildă, s-au utilizat fragmente de "gene sintetice", administrate cu ajutorul unui vector realizat prin fuzionare de hpozomi cu virusul Sendai, sau HVJ (,Jiemagglutinaling virus of Japon"), căutând a deturna factorii NFkB sau E2F de la ţintele lor naturale.
In ultima vreme, NFkB a început să intereseze tot mai mult domeniul canceroiogiei. Din cele descrise mai jos, se va vedea că "obiectivul" NFkB este extrem de complex, fiind implicat într-o serie de reacţii rapide "normale" ale celulei (Fig. 8.7, registrul de sus) şi că "manipularea" lui se va dovedi foarte pretenţioasă.
Rolul factorului nfkb |
sus |
Factorul nuclear NFkB se fixează pe ADN sub forma unor homo sau heterodimeri. Precursorii acestora sunt menţinuţi prizonieri în citoplasmă sub forma unor complexe constituite din trei molecule: un "heterodimer" constituit dintr-o subunitate "mare" şi una "mică", precum şi proteina-inhibitor IkB. Denumirile abundă şi invită ia confuzie:
- "Subunitatea mare", poate fi o proteină Rel, una dintre (onco)proteinele c-Rel, Rel B sau p65.
- "Subunitatea mică" poate fi reprezentată de o proteină p50 (provenită dintr-un precursor pi65), sau p52 (din precursor pi 00). Prin eliberarea din citoplasmă (activarea) heterodimerului NFkB,
acesta migrează în nucleu, unde se fixează pe secvenţele-promotor ale unor
gene, care sunt în acest fel activate la rândul lor.
Fig. 8.7 (registrul de jos) descrie funcţionarea complexului de
proteine IKK. care controlează în două moduri diferite, activarea proteinei NFkB şi genele care vor fi apoi induse să se exprime.
. Complexul IKK este alcătuit din subunităţile proteice IKKa, IKK(3 şi IKKy. Stimulat fiind prin interacţiunea cu factorul necrozam de tumori (TNFa), cu interleukina-1 (IL-1). sau cu lipopolizaharidele (LPS), se "activează" subunitatea IKKp, care fosforilează două serine aparţinând proteinei IkB.
Această proteină blocase în citoplasmă heterodimerul NFkB. Drept urmare, proteazomul 26S este capabil să o atace şi să o degradeze (Fig. 8.7, stânga). Devin libere subunitatea mică p50 şi proteina Rel A, care constituie împreună heterodimerul p50 / Rel A, ce poate migra în nucleu, unde va activa o anumită categorie de gene.
. Stimularea complexului IKK prin interacţiune cu alţi factori, cum ar fi limfotoxina B (LTB), activează subunitatea IKKa, care, la rândul său, fosforilează două serine şi extremitatea carboxil a proteinei-precursor pi00 (legată de subunitatea "mare" Rel B). Jumătatea C-terminală a acesteia va fi apoi degradată, lăsând intactă jumătatea N-terminalâ (devenită acum subunitatea "mică" p52), care continuă să fie legată de Rel B (Fig. 8.7, dreapta). Complexul Rel B / p52 poate acum migra spre nucleu, unde va interacţiona şi activa o altă categorie de gene. Această a doua categorie conţine gene implicate în proliferarea malignă a celulei şi xascularizarea tumorii, precum şi în blocarea apoptozei. Este calea care conduce la cancer. Mai mult decât atât, cealaltă ramură, activată, de pildă prin TNFa, nu numai că nu conduce la cancer, dar produsul de degradare al lui IkB poate stimula apoptoza!
în general, fixarea heterodimerilor pe ADN conduce la activarea genelor respective, iar fixarea sub formă de homodimeri de tipul p50/p50, sau p65/p65 are efect represiv. (De exemplu, myotrofina V-i, prezentă în cerebelul noului născut, sau în muşchiul cardiac după infarct, este o proteină cu rol de regulator, care induce formarea de homodimeri în dauna heterodimerilor NFkB).
Proteazomul şi gena NFkB în cancer
Medicamentele destinate combaterii cancerului vizează, în general, etape-cheie ale ciclului celular, sau "ţinte" uşor de intuit: replicarea ADN-ului (antraciclinele, cis-platinul), microtubulii esenţiali în constituirea fusului mitotic (taxol), căile de semnalizare ale factorilor de creştere celulară (gleevec, pentru leucemia mieloidă cronică, herceptin, pentru cancerul de sân), sau angiogeneza (endostatin). Proteazomul reprezintă o ţintă nesperată.
Proteazomul este o enzimă esenţială, căci ea este aceea care "curăţă" celula de proteinele indezirabile, inclusiv după declanşarea apoptozei. .
Proteazomul are o formă de cilindru, prin care "pasează proteinele destinate a fi degradate, precum şi cele defecte, reducându-le la fragmente în vederea reciclării.
Rolul proteazomului este, deci, de neînlocuit. Cu atât mai surprinzătoare a fost descoperirea că produsul PS-341. un inhibitor al proteazomului, (actualmente în faza a doua de eseu clinic!) tratează mielomul multiplu, (incurabil pe alte căi) ... fără a ucide şi pe pacient! E drept că proteine de tipul ciclinelor, de exemplu, trebuie să dispară (graţie proteazomului) înainte ca celula să poată fi antrenată în etapa următoare a ciclului celular, iar acumularea de cicline ar fi capabilă să împiedice proliferarea tumorii. Se pare însă că eficacitatea lui PS-341 se datorează de fapt inhibării procesării factorului NFkB, descrisă mai sus. Această inhibiţie este atât de intolerabilă celulei canceroase, încât simpla administrare periodică a medicamentului este suficienta pentru a-i induce apoptoza. Spre deosebire de acestea, celulele normale (degradând mai puţine proteine) au posibilitatea să se refacă în răstimpul^ dintre administrări. O nouă cale de atac a cancerului este astfel preconizată.
Angiogeneza şi proteina p53
Este o şansă nesperată faptul că celulele canceroase nu rezistă la inhibarea proteazomului! Din contră, o cale de atac care părea intelectualmente atractivă, aceea de a împiedica vascularizarea tumorii prin inhibarea angiogenezei, nu a dat pentru moment rezultatele sperate.
Tratamentul cu endostatine (dintre care există vreo 40 de varietăţi în studiu), nu împiedică dezvoltarea tumorii atunci când sinteza proteinei "supresoare de tumori" p53 este inactivată - ceea ce se întâmplă în cel puţin 50% de cazuri de tumori. Se pare că inactivarea proteinei p53 conferă celulelor un potenţial superior de supravieţuire în condiţiile de hipoxie cauzate de vascularizaţia deficitară. Tratamentul cu endostatine. eficient la început, duce la selectarea acelor celule în care proteina p53 este mutantă (sau inactivă) şi care sunt tolerante la hipoxie.
Nu trebuie înţeles din acest exemplu că direcţia de atac ar fi compromisă. Ea cere însă noi eforturi şi imaginaţie. De exemplu, terapia cu endostatine ar putea fi suplimentată prin administrarea concomitentă a unor medicamente care să distrugă vascularizaţia tumorii deja existentă, sau care să distrugă doar celulele hipoxice.
Strategia aptamer
După succesul inhibării genei HER2 cu un oligonucleotid destinat a forma un triplu-helix. am preconizat utilizarea aceleaşi strategii pentru inhibarea genei răspunzătoare de TNFa (Junior necrosis factor", factorul necrozam al tumorii). Această proteină-semnai. pe care am întâlnit-o mai sus în legătură cu stimularea factorului NFkB, joacă un rol complex într-o varietate de patologii, printre care şi inflamaţia reumatismală. Am sperat să dezvoltăm un oligonucleotid care să poată fi injectat direct în articulaţia dureroasă, căreia să-i ..calmeze" criza.
Experienţa a reuşit. Oligonucleotidul pe care l-am conceput a demonstrat o puternică inhibiţie a nivelului de expresie a genei respective într-un model experimental de "inflamaţie". constituit de celule THP-1 (o linie monocitară umană), stimulate în prealabil printr-un tratament cu lipopolizaharide şi interferon gamma. Secvenţa constituie obiectul unui brevet, fntr-o zi, poate, un industriaş se va decide să-1 cumpere şi să-1 comercializeze.
Pe parcursul experimentării, ne-am ciocnit tot mai mult de tendinţa oligonucleotidului de a se autoasocia.
Să ne reamintim faptul că ţinta vizată de un oligonucleotid care va forma un triplu-helix trebuie să fie constituită preponderent din purine (G şi A) şi că în oligonucleotidul însuşi vor predomina purinele. Această tendinţă de auto-asociere este comună tuturor oligonucleotideîor bogate în guanine (G), inclusiv acelora care reproduc secvenţe ale telomerilor. Ea se datorează capacităţii guaninelor de a constitui tetrade de guanine (Fig. 8.8), care pot sta la baza unui "helix cvadruplu", sau tetraplexl. Adevărul este că în numeroase cazuri nici nu putem fi siguri dacă oligonucleotidul a fost eficient pentru că a acţionat în sensul dorit, adică formând un triplu-helix cu gena vizată, sau pentru că s-a asociat cu el însuşi formând un tetraplex, care a jucat în continuare rolul de aptamer, de inhibitor al vreunei proteine importante.
Strategia aptamer se bazează tocmai pe capacitatea oligonucleotideîor de a se asocia, sau de a se plia în structuri compacte, care sunt "recunoscute" în mod specific de anumite proteine cu rol-cheie în procesele fiziologice şi de pe urma cărora proteinele respective îşi modifică comportamentul.
Două cazuri de aptameri oligonucleotidici (descoperiţi prin voia hazardului, de altfel!) sunt deja binecunoscuţi şi se va mai auzi vorbindu-se despre ei: inhibitorul trombinei şi inhibitorul virusului HIV-1 (secvenţa şi structura acestuia din urmă sunt ilustrate în Fig. 8.9).
Oligonucleotide-aptamer inhibitori ai topoizomerazei II
Noi am abordat strategia aptamer în legătură cu o enzimă-cheie în cancer, topoizomeraza II. Obiectivul nostru nu a fost atât inhibarea enzimei (căci, după cum se va vedea mai încolo, suntem în posesia de inhibitori mult mai versatili şi eficienţi ai acesteia), cât aprofundarea (şi elucidarea) metodologică a domeniului tetraplecşilor oligonucleotidici. Redăm aici argumentul de bază, pentru a ilustra complexitatea comportamentului unor molecule aparent simple.
Topoizomeraza II, enzima care scindează şi releagă ADN-ul pentru a-l relaxa, are şi ea preferinţe de secvenţă. Două lanţuri complementare de ADN, de 19 nucleotide fiecare, caracterizate prin secvenţe invers-repetate (oligonucleotidele 19-ATC şi 19-GAT) aparţin locusului preferenţial de clivaj al ADN-ului de către topoizomeraza II în plasmida pBR322 în prezenţa unui derivat de ellipticină (Fig. 8.10a). Fiecare lanţ în parte poate fi repliat ca să formeze o tijă autocomplementară închisă de câte o buclă de trei nucleotide (ATC, respectiv GAT, Fig. 8.10b).
Noi am constatat că, atunci când nucleotidele respective sunt
prelungite la extremităţi:
. (i) cu 7 nucleotide, aparţinând secvenţei originale din pBR322, creând astfel joncţiuni monocatenare/dublu-catenare la fiecare din extremităţile 5\' şi 3\' ale oligonucleotidelor, sau
. (ii) cu câte o secvenţă de 7 guanine, capabile de interacţiuni de tip Jfoogsleeri", care pot conduce la formarea de duplexuri
sau tetraplecşi non-Watson-Crick. oiigonucleotidele devin inhibitori ai topoizomerazei II. Diversele moduri de repliere ale acestora sunt ilustrate în Fig. 8.10 c-f pentru molecula de 33 de nucleotide derivată din 19-ATC.
Să examinăm pe rând aceste structuri:
. Structura (d) este un duplex Watson-Crick, imperfect în porţiunea centrală (secvenţele ATC/ATC nu sunt complementare şi formează o "umflătură", un ,J)tdge"), iar cele 4 "ramuri" de câte 7 guanine sunt libere, nestructurate.
. Dimpotrivă, în structura (c), oligonucleotidul s-a pliat în două, formând o tijă bazată pe complementaritate Watson-Crick (,ftem"), iar lanţurile guaninelor, repliate şi ele, au alcătuit un tetraplex cu două "platouri" de G (zis "antiparalel", căci lanţurile sunt antiparalele două-câte-două).
. In structura (e), două stem-un sunt alipite prin intermediul lanţurilor de guanine, care se "recunosc" prin interacţiuni Hoogsteen similare celor care au permis formarea triplului-helix (revezi Fig. 8.1).
. în fine, în structura (f), patru asemenea stem-un sunt dispuse în
paralel şi menţinute de guaninele care, de data aceasta, formează
un tetraplex paralel.
Toate aceste structuri se realizează în soluţie, deşi în primele clipe este favorizată structura (c), pentru că este monomoleculară. Ea este cea mai compactă şi migrează cel mai rapid într-un gel de electroforeză non-denaturant (vezi pista din dreapta în electroforeză din Fig. 8.11c).
Ulterior sunt preferate structurile bi şi tetramoleculare (pista a doua). Simpla înlocuire a buclei ATC prin GAT în oligonucleotidul 19-GAT modifică comportamentului întregului stern, astfel că se formează doar două dintre cele patru structuri posibile (pistele 3 şi 4). Am reuşit să asociem câte o bandă de dicroism circular fiecăreia dintre elementele structurale prezente în aceste molecule (Fig. 8.11 a-b).
Iată cum:
- Un lanţ de guanine dezordonat are drept "semnătură" curba (5),
cu un maxim pozitiv la 254 nm.
. In apă (I), oligonucleotidul 33-ATC adoptă o structură în stern
(un stem Watson-Crick fiind caracterizat prin banda pozitivă de la
280 nm) cu braţele flotante (banda de la 254 nm).
- In prezenţă de ioni pozitivi, toate modurile de repliere sunt prezente (4).
Toate conţin semnătura împerecherii Watson-Crick (banda de la 280 nm), iar restul contribuţiilor se suprapun în speţă, am identificat contribuţia tetraplexului paralel şi a duplexului Hoogsteen, ambele caracterizate printr-o bandă la 260 nm (6) şi a tertaplexului antiparalel, caracterizat printr-o bandă la 295 nm (7).întrebarea care persistă este următoarea: care dintre aceste structuri este cea răspunzătoare de inhibarea topoizomerazei II? Mă opresc aici cu povestirea.
... Biofizicianul care concepe noi medicamente, începe întotdeauna prin a înţelege moleculele active la acest nivel de detaliu. Apoi studiază interacţiunile lor în sisteme reconstituite (in vitro), după care le testează pe celule în cultură (ex vivo), ca apoi să le încerce in vivo, pe animal...
Trecem să studiem sida |
sus |
La data când încheiam lucrul la acest capitol conex al cancerologiei, eram deja antrenaţi într-un domeniu cu totul diferit, cel al Sidei. Cum am ajuns la această nouă preocupare (care, de altfel, n-a fost decât o lărgire a preocupărilor precedente, cu revenire spectaculoasă tot la cancer)?
Pe la începutul anilor \'90, în Franţa, un prim-ministru socialist făcuse boacăna de a răspunde unui memoriu, prin care era informat că "tot stocul de sânge de transfuzie al ţării este contaminat cu SIDA", prin fraza următoare: "să fie întrebuinţat până la epuizare". Nu numai că n-a fost condamnat de justiţie, dar, judecat fiind de un ,juriu de onoare" alcătuit din deputaţi (căci, vezi-doamne, un ministru e mai presus de legile propriei ţări), a transformat evenimentul într-un triumf personal: un om politic nu era dator să fie competent în vreo meserie oarecare!
Tot pe la începutul anilor \'90, cei care lucrau în domeniul cancerului erau stăpâniţi de sentimentul că principalele direcţii de atac erau pe punctul da a fi precizate şi că dacă s-ar pune în joc toate forţele lumii ştiinţifice, s-ar putea da de capăt bolii până la sfârşitul veacului.
Cam în aceeaşi perioadă şi provenind de la aceeaşi cancelarie, ne vine însă (celui mai important centru de cancerologie, poate, al Europei!) solicitarea: "găsiţi-vă alt domeniu de studiu, căci Statul nu va mai finanţa cercetarea asupra cancerului". Motivul invocat: abia se acoperise necesarul de spitale
şi de medici chirurgi şi radiologi şi investiţia nu se amortizase încă! Nu ştiu care e adevăratul substrat - gurile rele ziceau că se credea că, oricum, americanii vor rezolva ei totul pe banii lor. în America, însă, situaţia n-a fost mai roză: acolo s-a invocat faptul că ponderea populaţiei vârstnice era deja prea importantă şi că nu era de dorit să se găsească un remediu rapid principalei cauze de mortalitate...
Cert este că ne-am orientat în masă spre celălalt domeniu în vogă la acea dată, cel al retro-virologiei, al Sidei. Incursiunea în acest domeniu a fost profitabilă însă tuturor, căci, la nivel molecular, ai întotdeauna de învăţat ceva despre lumea vie, indiferent de unghiul din care ai aborda-o, iar un principiu general, odată ce a fost precizat, permite exploatarea lui în toate domeniile conexe. Aşa se face că, un timp, am lucrat nemijlocit pe retroviruşi, dar că, încet-încet, am descoperit că eram din nou în domeniul cancerologiei. Capitolul următor descrie această etapă a parcursului meu profesional.
Principii de bază
