intelegerea mecanismelor de codificare, stocare si accesare a informatiei genetice precum si a celei de transfer al acestei informatii la generatii succesive presupune familiarizarea cu:
- compozitia si structura moleculara a acizilor nucleici;
- enzimele asociate acizilor nucleici;
- mecanismele de replicare a ADN-ului;
- modificarile post-transcriere a ARN-ului mesager;
- traducerea ADN-ului intr-o proteina;
- mecanismele de control ale transcrierii;
- mecanismele de reparare a ADN-ului. Descrierea in detaliu a acestor aspecte este in
afara scopului prezentului modul. Tehnologiile cu ajutorul carora se pot analiza acizii nucleici este insa necesar a fi examinate mai in detaliu. Familiarizarea cu aceste tehnici va permite intelegerea directiilor de cercetare ce vor putea influenta abordarea patologiei chirurgicale si cu ce instrumente s-a ajuns la obtinerea unor rezultate, uneori spectaculoase, cum ar fi obtinerea unor tesuturi sau chiar organe, pornind de la cultivarea unor celule in tro sau modificarea expresiei unor gene.
Un inventar (incomplet) al instrumentelor cu care se studiaza acizii nucleici ar putea fi urmatorul:
. metodele de separare electroforetica a acizilor nucleici;
. tehnicile de hibridizare a acizilor nucleici;
. metode de amplificare:
- reactia de polimerizare in lant;
- alte tipuri de metode de amplificare;
. metode bazate pe determinarea lungimii fragmentelor de restrictie (RFLP = restriction fragment length assays).
Separarea electroforetica este bazata pe migrarea cu teze diferite, dependente de greutatea moleculara sau lungimea moleculelor de acizi nucleici, intr-un camp electric, ca urmare a distributiei uniforme a fosfoglucidelor din compunerea moleculelor. Analiza electroforetica se realizeaza dupa desfacerea prealabila a lanturilor bicatenare, iar moleculele pot fi analizate in urma tratarii cu enzime de restrictie.
Tehnicile de hibridizare se bazeaza pe structura dublu catenara a ADN-ului. Legaturile intre cele doua lanturi este reversibila si specifica, prin secvente complementare. Atunci cand catenele nu sunt marcate procesul de refacere a structurii dublu catenare poarta numele de annealing. Daca o catena este marcata, ea poarta numele de "sonda\" moleculara iar procesul de reconstituire a unui lant dublu catenar este denumit "hibridizare\". Molecula hibrid este denumita astfel pentru ca este formata dintr-o catena marcata si una nemarcata. Hibridizarea se poate produce si intre doua lanturi complementare de ARN.
Specificitatea reactiilor de hibridizare este determinata de tipul de sonde moleculare utilizate. S-au facut analogii asupra tehnicilor de hibridizare cu cele de reactie imuna, iar sondele au fost ate (sub aspectul specificitatii) cu
anticorpii din reactiile imunologice.
Sondele moleculare sunt fragmente de ADN sau ARN cu structura cunoscuta ce poarta o regiune "reporter\" (radioactiva sau non-radioactiva, pentru identificare). Metodele de hibridizare sunt variate, fiecare proiectata pentru a rezolva probleme specifice hibridizarii:
- hibridizare in faza lichida;
- hibridizare pe suport solid.
Reactia de polimerizare in lant reprezinta o metoda de amplificare in tro a unor secvente specifice de ADN. Pornind de la cantitati infime ale unei secvente de acid nucleic, provenind din orice sursa, cu ajutorul acestei metode se pot genera pe cale enzimatica milioane sau miliarde de copii identice ale secventei initiale. Reactia de polimerizare in lant implica parcurgerea unor serii repetitive de cicluri de temperatura cu trei etape:
- denaturarea moleculei de ADN la peste 91 °C, pentru a separa cele doua catene ale moleculei de ADN;
- revenirea la aproximativ 50°C pentru a permite refacerea structurii bicatenare, cu ajutorul unor primeri (oligonucleotide cu secventa determinata) (annealing);
- in final extensia primerilor de catre ADN-poli-meraza.
Cu ajutorul acestei tehnici genele se pot sintetiza in tro. Ulterior materialul obtinut poate fi secven-tat. Metoda este ideala pentru diagnosticul prenatal, pentru ca doar mici urme de ADN fetal sunt necesare pentru amplificare. Similar, metoda permite identificarea precoce a materialului genetic de origine rala, in stadii precoce, inaintea oricarui raspuns imunologic al persoanei infectate.
