Controlul calitatii in laboratoarele de citologie cuprinde modul de preparare-colorare (Papanicolau), protocolul de examinare microscopica SPADE, normele de functionare ale laboratorului (numar minim si maxim de lame/zi), precum si controlul calitatii elaborarii rezultatelor.
Se foloseste clasificarea Bethesda. Medicii si tehnicienii implicati trebuie sa fie foarte bine pregatiti si sa se supuna unui control al calitatii riguros mai ales la citirea lamelor suspecte. De-a lungul timpului s-au luat mai multe masuri de ameliorare a eficacitatii sistemelor de depistare. De exemplu, cand diagnosticul de cancer de col s-a pus intre examenele de depistare, trebuiesc recitite de catre experti lamele anterioare pentru a dea de ce actiunea nu a depistat cazul respectiv intr-o etapa evolutiva incipienta. Inrs, cand interntiile practicate pentru citologii suspecte denota leziuni benigne, trebuiesc de asemenea recitite frotiurile.
Cuprins:
Introducere |
sus  |
O altă măsură constă din organizarea unor īntruniri periodice ale cititorilor de frotiuri, medici sau tehnicieni, ocazie cu care să li se testeze capacitatea de diagnostic prin examinarea unor lame corespunzătoare unor diverse stări lezionale. Cu această ocazie, pot ei īnşişi să-şi constate eventualele insuficienţe. O metodă frecvent utilizată este examinarea de către un colectiv de experţi a 4-10% din lamele citite, alese prin sondaj. Poate fi astfel analizată calitatea tehnică a lamelor şi se pot compara diagnosticele. Nu trebuie ofensaţi citologii, ci ei trebuie stimulaţi pentru a se perfecţiona permanent.
Toate aceste metode reprezintă forme ale controlului calităţii.
Conceptul controlului calităţii īn toate domeniile medicale este extrem de important. Nu este suficient ca un examen să fie efectuat. El trebuie īn acelaşi timp să fie şi bine făcut. Scopul controlului calităţii nu este de a controla fiecare examinator, ci de a-1 determina să depună eforturi proprii īn reducerea riscurilor de erori printr-o autoevaluare şi o perfecţionare continuă.
īn afara erorilor de examinare ce pot fi atribuite examinatorului sunt recunoscuţi factori care pot interveni īn elaborarea de rezultate fals-negative: existenţa de celule anormale pe frotiu, dar care nu au fost vizualizate, celule vizibile īn cāmp dar
neobservate fiind īn număr mic pe un fond de hipercelularitate, celule vizualizate şi observate dar nerecunoscute (fiind mici, bine diferenţiate, uscate la aer, contrast scăzut etc); toate aceste vicii pot fi atribuite īntr-o oarecare măsură unor limite, pānă la un punct inerente, ale metodei microscopice.
īn afara limitelor metodei şi a examinatorului lamei contează mult şi organizarea laboratorului din punctul de vedere al timpului de lucru/volum. Problema vigilenţei citologului a fost comparată cu studiul lui Mackworth care, īn timpul celui de-al 11-lea război mondial a fost solicitat de Royal Air Force să determine motivele pentru care submarinele nu erau observate pe radare; el a demonstrat că atenţia celor de la monitoare scade rapid īn prima jumătate de oră după 2 ore de supraveghere şi scade constant īn continuare īn următoarea o oră şi jumătate. Vigilenţa citologului a mai fost comparată şi cu cea a controlorilor de zbor; īn ambele cazuri scăderea vigilenţei poate fi fatală, diferă doar numărul de persoane afectate şi timpul de instalare a consecinţelor.
Timpii standard de examinare şi de recreere trebuie riguros respectaţi.
O proporţie mare de rezultate fals-negative poate fi atribuită laboratoarelor de citologie: un studiu al rezultatelor a 300 de laboratoare a relevat 7,5% diagnostice fals-negative pe frotiuri cu displazie moderată sau chiar franc maligne şi 8,9% diagnostice fals-pozitive pe frotiuri cu aţipii benigne. Aceste date au fost comunicate īnainte de anul 1990, cānd s-a generalizat utilizarea clasificării Bethesda (clasificare care a introdus un mare număr de frotiuri benigne īn categoria de "atipice", cu potenţial invaziv redus, dar care au fost altfel urmărite īn timp).
Asigurarea calităţii laboratoarelor |
sus |
Asigurarea calităţii laboratoarelor se face la nivelul bazei de date generale a screening-ului.
Termenii de control al calităţii şi asigurare a calităţii nu sunt sinonimi: activităţile de control a calităţii presupun asigurarea respectării normelor după care trebuie să se desfăşoare procesele implicate īn realizarea testului, avānd un caracter prospectiv, īn timp ce asigurarea calităţii reprezintă măsurarea retrospectivă a realizării scopului testului. Această relaţie īntre materiale, metode şi rezultate este universală. Activităţile de control al calităţii şi de asigurare a calităţii trebuie practicate continuu pentru a asigura şi măsura performanţele testului, pentru a identifica şi corecta din mers deficienţele.
Rescreening-ul randomizat a 10% din lamele negative, care evaluează performanţele citologului, reprezintă o metoda probabilistică caracteristică asigurării calităţii, īn timp ce rescreening-ul de rutină al tuturor lamelor bolnavelor cu risc crescut este o metodă de control al calităţii aplicată prospectiv.
Există cāteva metode curente de măsurare a erorilor testului. Acestea includ rescreening-ul randomizat al frotiurilor negative sau al frotiurilor negative care au corespuns la leziuni displazice avansate (corelaţie cu biopsiile). Toate aceste metode au ca scop determinarea RFN (ratei fals-negative).
Calculul RFN se face cu formule standard.
Pentru a explica metodele de determinare a RFN trebuie mai īntāi definiţi termenii implicaţi:
- rezultatele fals-negative - erorile de recoltare sunt definite prin lipsa celulelor unei leziuni īn frotiu, iar erorile de diagnostic au loc atunci cānd celulele sunt prezente īn frotiu dar nu au fost recunoscute sau identificate;
- gold-standard - eroarea se evaluează īn comparaţie cu o interpretare "reală" sau gold standard: biopsie sau alt frotiu; ambele pot fi la rāndul lor eronate (biopsie sau secţiune anatomopatologică lāngă leziune, eroare de diagnostic de frotiu). Revizuirea "expertă" a lamei iniţiale poate detecta numai erori de diagnostic, nu şi erori de recoltare. Fiecare metodă are un gold standard diferit şi RFN este afectată de alegerea acestuia;
- rata fals-negativă - reprezintă numărul de erori īntr-o populaţie definită; dacă este calculată pentru tot volumul de lucru al unui laborator, ea poate fi modificată de alţi factori decāt RFN a screening-ului (ratele displaziilor severe pot fi foarte diferite de la un laborator la altul);
- fracţia fals-negativă - compară rata erorilor cu populaţia bolnavă:
FFN = FN/(AP-FN).
Ecuaţia implică o sensibilitate crescută şi este folosită īn multe alte domenii: inginerie, radiologie, medicină de laborator etc.
Metode de asigurare a calităţii prin calculul RFN
- compararea cu rezultate pozitive furnizate de clinicieni prin alte metode decāt citologia. Pot exista diferenţe īn 6-18% dintre interprerările date displaziilor de laboratoare diferite.
- rescreening-ul reprezintă metoda adoptată prin consens īn 1988 de către laboratoarele din S.U.A. Se măsoară doar RFN diagnostică şi se calculează rata fals pozitivă RFP după:
ecuaţia 1 RFN = FN/(AP = FN);
ecuaţia 2 RFN = RFN calculată / (1 - RFN rescreening);
ecuaţia 3 RFP = FP/(FP - AN);
ecuaţia 4 RFP ■ RFP calculată / (1 - RFP rescreening);
- metode de comparare RFN: Thinprep,CytoRich, PAPNET, AutoPap 300 QC.
Determinarea RFN este utilă īn evaluarea unui laborator, īn compararea laboratoarelor şi pentru a semnala necesitatea luării de măsuri pentru ameliorarea performanţelor acestora.
īnainte de a īncepe un program de screening, resursele tehnice pentru recoltarea frotiurilor trebuie să se găsească la faţa locului, iar un laborator de citologie trebuie să fie disponibil pentru a le examina şi a elabora rapoarte. Pentru a ne asigura că laboratoarele sunt eficiente atāt din punct de vedere ştiinţific cāt şi al costurilor, acestea trebuie să fie supravegheate permanent de un citopatolog (cu norma īntreagă), cu un sistem organizat de asigurare a calităţii şi o perfecţionare continuă a ci-totehnicienilor.
Controlul de calitate al laboratorului |
sus |
Citologia este o disciplină extrem de dificilă iar citologia cervicovaginală este ramura cea mai dificilă a acestei discipline.
īn prima fază a citirii lamelor intervine citotehnicianul care conform reglementărilor date de Colegiul Patologilor Americani trebuie să fi urmat un curs de specializare de 1-2 ani, timp īn care să fi examinat minimum 10 lame/zi, iar dintre acestea minimum 100 să fi prezentat atipii nucleare. Cu această pregătire şi un minimum de experienţă de 3 ani citotehnicianul va ajunge la performanţa maximă de 60 lame lecturate/zi, maximum 12 lame/oră cu pauze de 10 minute după o oră. Timpul necesar examinării lamelor īn această etapă a screening-ului este de aproximativ 6,1 ±3,3 minute/lamă, examinarea efectuāndu-se cu ocular lOx şi obiectiv 6x.
īn cea de-a doua fază intervine medicul anatomopatolog, care revizuieşte aproximativ 5% din lamele lecturate de citotehnician, procent ce reprezintă numărul aproximativ al cazurilor cu atipii citologice existente la populaţia feminină. Odată identificate atipiile, studiul şi īncadrarea lor necesită un timp de aproximativ 20 min/lamă, iar examinarea se efectuează cu ocular lOx şi obiectiv 20x şi 40x. Acest factor uman (citotehnician + medic) ar putea fi īnlocuit de un sistem automat de lecturare a lamelor "PAPNET", dar care este īncă mult prea costisitor. Acesta ar putea fi folosit īn controlul de calitate al activităţii citologului, prin reexaminarea a aproximativ 10% din lamele diagnosticate ca "negative".
īn Romānia, la Institutul Oncologic "Ion Chiricuţă" Cluj,īncadrarea leziunilor colului uterin se face īncepānd din martie 1995 conform clasificării "Bethesda 1991", forma revizuită a clasificării propuse īn 1988 īntr-un "work-shop" organizat de Institutul Naţional de Cancer din S .U. A. Programul ONCOPROTECT şi Laboratorul RADUSAN folosesc aceeaşi clasificare, care o īnlocuieşte pe aceea propusă de Papanicolau īn 1943 sau modificările ei ulterioare, deoarece īncadrarea leziunilor sub formă de numere, fără descrierea modificărilor existente, nu era de prea mare folos clinicianului, de multe ori neglijāndu-se aspectele atipice. īn plus, introducerea noţiunii de displazie agravată ca entitate separată de carcinomul "in situ" de către Reagan īn 1953 şi apoi a noţiunii de CIN (Cervical Intraepithelial Neoplasia) de către Richart īn 1966 a lansat "pe piaţă" o sumedenie de denumiri, unele dintre ele fără corespondent histologic. īn acest haos, trebuia făcută ordine; ordinea se numeşte
clasificarea Bethesda, adoptată urgent de peste 80% din laboratoarele de citologie americane. Ea instituie o terminologie unică care facilitează comunicarea ci-tolog/histolog/ginecolog şi care permite un "follow up" (urmărire) corespunzător. De altfel, din 1993, multe din laboratoarele din Europa, īn urma recomandărilor Comisiei Europene pentru screening-ul de col uterin, folosesc o clasificare aproape identică cu cea de peste ocean .
Calitatea frotiului |
sus |
Prima parte a clasificării Bethesda se referă la calitatea frotiului şi deci īn prim timp citologul va aprecia dacă frotiul permite formularea unui diagnostic de certitudine. Prima condiţie pentru realizarea unui frotiu de calitate este recoltarea corectă. Este indicat ca recoltarea să fie efectuată de un personal special instruit īn acest scop, de preferat cadru medical. Din motive economice este suficientă efectuarea unei singure lame, care să conţină aproximativ 50.000-300.000 de celule epiteliale, iar cel puţin 50 dintre ele să fie de la nivelul endocolului. Celulele trebuie să alcătuiască un strat subţire, uniform, pe toată suprafaţa lamei, deci pe aproximativ 600 cāmpuri microscopice.
Calitatea frotiului depinde, alături de modul de recoltare de gradul īn care se pot identifica detaliile nucleare (cromatina - nucleolii), detalii care separă nucleii tipici de cei atipici. Aceste detalii se obţin prin fixarea şi colorarea corectă a materialului recoltat. Metoda cea mai bună de fixare este introducerea rapidă şi menţinerea lamei īn alcool de 95%. Alţi fixatori posibili, cum ar fi isopropanololul, "spray"-urile fixatoare, sunt īntrebuinţaţi pe larg. Metoda de colorare introdusă īn 1941 de Papanicolau, cu oricāte modificări i s-au adus, cuprinde 23-30 timpi de colorare (Tab. 4.1). Calitatea ei este apreciată subiectiv (colorarea "Somon" pentru citoplasmă). Coloraţia propusă de autori este o coloraţie īn 2 timpi, preluată de la citologii hematologi.
Cu aceste două condiţii īndeplinite (recoltare/colorare corecte) un citolog foarte experimentat poate sesiza minimum 25 celule atipice atunci cānd ele sunt distribuite īn maximum 5 cāmpuri microscopice; legile citologiei spun īnsă că numai un număr minim de 100 celule atipice permite formularea corectă a diagnosticului. Este menţionat īnsă că nu numărul celulelor dă gravitatea leziunii.
Deci calitatea unui frotiu poate fi: satisfăcătoare, satisfăcătoare dar limitată şi nesatisfăcătoare. Procentul maxim admisibil pentru frotiuri ncsatisfăcătoare este de 5%. īn SUA sunt centre cu numai 2,5% sau chiar 0,3% (Iowa -University) frotiuri nesatisfăcătoare.
1. Alcool etilic 99% (3 scufundări a lamei) 13. Alcool etilic 95% (5 scufundări a lamei)
2. Alcool etilic 70% (3 scufundări a lamei) 14. Orange Gfi (2 min)
3. Apă distilată (5 scufundări) 15. Alcool etilic 95% (3 scufundări a lamei)
4. Hematoxilină Harris (3 min.) 16. Alcool etilic 99% (3 scufundări a lamei)
5. Apă distilată (3 scufundări) 17. Eosin-azur E A50 (2 1/2 min)
6. Alcool etilic 70% (3 scufundări a lamei) 18. Alcool etilic 95% (5 scufundări a lamei)
7.HC1 1%+alcool etilic 70% (3 scufundări) decolorare pānă la culoarea somonului 19. Alcool etilic 95% (5 scufundări a lamei)
8. Alcool etilic 70% (5 scufundări a lamei) 20. Alcool etilic absolut (5 scufundări a lamei)
9. Alcool etilic 70% (5 scufundări a lamei) 21.Xilen
10. Amoniac 3% + alcool etilic 70% (30 sec.) 22. Xilen
11. Alcool etilic 70% (5 scufundări a lamei) 23. Montare cu balsam Canada şi lamelă
12. Alcool etilic 70% (5 scufundări a lamei)
De ce este atāt de importantă această "evaluare a frotiului"? Un frotiu nesatisfăcător declarat negativ scoate femeia din programul de urmărire. Un studiu efectuat de lowa - University a demonstrat că 16% din femeile cu frotiu nesatisfăcător declarat negativ au dezvoltat leziuni premaligne (SIL de diferite grade) sau maligne (carci-nom invaziv).
Diagnosticul descriptiv |
sus |
Cea de-a doua parte a clasificării Bethesda cuprinde diagnosticul descriptiv cu categoriile aspect normal sau leziuni benigne. In această "zonă" rolul citotehnicianu-lui este hotărātor. Există un studiu efectuat īn Anglia de către Robertson şi colab. īn
1993 la femeile care au dezvoltat leziuni invazive īn decurs de 5 ani de la un examen citologic negativ:
- la 65% dintre ele, frotiurile iniţiale prezentau atipii de diferite grade;
- la 35% dintre ele, frotiurile erau negative.
Din cea de-a doua categorie, majoritatea erau femei tinere care au prezentat carcinoame invazive cu celule mici sau adenocarcinoame şi infecţie virală, īn majoritatea cazurilor cu HPV tip 18.
Diagnosticul patologic |
sus |
Ultima parte a clasificării Bethcsda, etapa de diagnostic patologic, aparţine medicului anatomopatolog. īn această etapă există categoriile "atipii ale celulelor pavimentoase sau glandulare cu semnificaţie incertă", categoriile "nu ştiu", care nu ajută clinicianul dar salvează patologul şi pacienta. Deci patologul are voie să nu ştie. Cāt? Maximum 5% din frotiurile cu atipii. Dacă totuşi acest procent se ridică la 10%, patologul trebuie reciclat iar laboratorul trebuie dotat cu tehnologia necesară depistării ADN-ului viral. Ar fi mult mai periculos a-1 obliga pe patolog să spună decis "pozitiv" sau "negativ" decāt să se refacă examinarea la 3-6 luni la femeile fără factori de risc sau imediat, plus colposcopie şi biopsie la cele cu factori de risc.
Atipiile din categoria "nu ştiu" ar putea fi inflamatorii sau de regenerare după cum, la fel de bine, ar putea aparţine unei leziuni premaligne sau maligne. La unul din 8 cazuri din categoria "nu ştiu" s-a demonstrat existenţa ADN-ului viral.
Pentru reducerea la minimum a categoriei "atipii cu semnificaţie incertă" este obligatorie īndeplinirea mai multor condiţii:
- perfecţionarea personalului medical prin cursuri, schimburi de experienţă;
- controlul calităţii prin revizuirea periodică intralaborator sau interlabo-ratoare a 10% din lamele identificate ca "negative" sau, mai nou, a tuturor lamelor identificate ca negative prin metoda recitirii rapide, pe o diagonală a lamei;
- identificarea ADN-ului viral.
Partea cea mai valoroasă a clasificării Bethesda o constituie īnsă introducerea noţiunii de leziuni intrapavimcntoase-SIL (squamous intraepithelial neoplasia). īn categoria SIL grad scăzut sunt īncadrate leziunile ce prezintă modificări combinate; atāt atipii koilocitare cāt şi atipii caracteristice displaziei uşoare (CIN I). īncă din 1977 Meisels a evidenţiat faptul că celulele koilocitare (Koilos = gaură) apar īn leziunile noncondilomatoase ale colului uterin, fiind legate de infecţia cu virusul Papiloma uman (HPV).
Se consideră atipie koilocitară celula superficială sau intermediară care prezintă un halou citoplasmalic clar, perinuclear, uşor excentric sau citoplasmă densă, intens colorată īn portocaliu sau verde şi īn plus prezintă nucleu uşor hipercrom, neregulat cu diametru maxim de 2-3 ori mai mare raţă de diametrul unei celule intermediare, cu cromatina tină, delicată, uniform distribuită şi membrana nucleară subţire.
īn cadrul leziunii CIN I se īncadrează celulele superficiale sau intermediare cu sau fără efect citoplasmatic viral care au nucleu hipercrom, neregulat, cu diametrul de 4 ori mai mare decāt al unei celule intermediare, cu cromatina cu grunji fini.
Separarea leziunilor care conţin numai koilocite de cele care au īn plus aţipii CIN I este aproape imposibilă pentru citologi şi īn plus s-a demonstrat că istoria naturală (rata de regesie şi rata de progresie) şi tipurile de HPV sunt similare pentru cele două tipuri de leziuni,īn această situaţie subdivizarea fiind nu numai anevoioasă dar şi inutilă.
īn ceea ce priveşte conduita ulterioară diagnosticului de SIL grad scăzut, recomandările diferă, dar majoritatea autorilor optează pentru supraveghere citologică la 6-12 luni. In cazul persistenţei aspectului atipic se recomandă colpo-biopsie.
īn categoria SIL grad ridicat sunt īncadrate leziunile care au aţipii citologice mai pronunţate ce interesează celulele din toate straturile epidermului pavimentos. Indicaţia terapeutică ulterioară diagnosticului este colpo-biopsia.
Introducerea clasificării Bethesda a īnfăptuit o serie de progrese, dar a creat totuşi şi uncie probleme.
Se impune deci perfecţionarea acestei metode de identificare a leziunilor colului uterin cu scopul ameliorării calităţii diagnosticului.
Prezentăm īn imaginile microscopice următoare o serie de aspecte tipice utile īn diagnosticul citologic al leziunilor intraepileliale ale colului uterin .
Introducere
