Tehnologiile existente de "radiografiere\" a celulelor sunt permanent imbunatatite si sunt pe cale de aparitie noi tehnologii. Astfel, numeroase categorii de coloranti fluorescenti sunt utilizate pentru a vizualiza structuri microscopice in situ, fara a modifica biochimia sau fiziologia celulei. O parte dintre acesti coloranti pot insa interfera cu procese biochimice celulare sau pot aa consecinte toxice pentru celule. O alta limitare a acestui tip de tehnologie este data de atenuarea rapida a proprietatilor de fluorescenta ale compusilor utilizati.
O tehnica noua, denumita CARS (acronim de la Coherent Anti-stokes Raman Scatering) utilizeaza doua fascicule laser ce baleiaza asupra unei celule, cu frecnte ce difera cu exact frecnta la care vibreaza o legatura chimica particulara din celula. Fotonii din cele doua lasere se "amesteca\", excita legatura chimica sa vibreze si sa emita un semnal propriu, la o frecnta diferita de a celor doua lasere. in principiu, intrucat laserele pot fi focalizate sa actioneze asupra unei portiuni restranse din ce-lula, se poate crea o "harta chimica\" a celulei studiate. Mitocondriile si membranele celulare, bogate in legaturi hidrogen-carbon pot fi vizualizate (ca distributie) in celula. Foarte la inceput, acest tip de tehnologie are ca principal dezavantaj durata necesara pentru obtinerea unei imagini (3).
Care sunt avantajele unui microscop confocal?
Microscopul confocai a fost at, la scara celulelor, cu computerul-tomograf, la scara organismului. Acest microscop creeaza sectiuni optice cu o grosime de circa 0,5 mm. Principalul avantaj i! reprezinta obtinerea unor imagini in care informatia situata in afara ului de focalizare este eliminata. Astfel, se minimalizeaza suprapunerea unor detalii, iar imaginile obtinute sunt de o claritate iesita din comun. Eliminarea informatiei aflate in afara ului de focalizare prin iluminare intr-un singur punct este combinata cu posibilitatea de a colecta informatiile de pe o suprafata si de a o stoca (95). Ulterior, imaginile pot fi prelucrate cu ajutorul unui computer, suprapuse si un software de reconstructie permite conrsia datelor in imagini cvasi-tri-dimensionale (54). Una dintre aplicatiile majore o reprezinta monitorizarea oscilatiilor ionilor de calciu, unul dintre mesagerii de ordinul II consacrati, in cele mai diferite tipuri de celule, in vivo (80).
Care sunt aplicatiile (din punctul de dere al chirurgului) ale citometriei in flux?
Citometria in flux este o tehnica pentru masurarea rapida, efectuata asupra particulelor sau celulelor, aflate in suspensie, si trecute, una cate una, prin dreptul unei sistem de detectie. in forma sa cea mai simpla un aparat de citometrie in flux este o combinatie a unui sistem fluidic de furnizare a probelor, un spectrofluorimetru si un fotometru de dispersie a luminii. in camera de masurare celulele sunt aduse, una cate una unui fascicul laser ce stimuleaza emisia si dispersia luminii.
Aplicatiile pentru diagnosticul clinic ale citometriei in flux sunt foarte numeroase: de la "simpla\" imuno-fenotipare, utilizata pentru testele de histocompa-tibilitate, sau pentru diagnosticul clinic de laborator in oncologia hematologica, la (foarte dirse) aplicatii in diagnosticul oncologic (5). O alta aplicatie importanta o reprezinta capacitatea unor tipuri de aparate de a efectua si sortarea celulelor (purtatoare ale unor seturi de antigene). Astfel se pot obtine populatii celulare (semnificati sub aspect numeric) de interes terapeutic (de exemplu celule stern). O astfel de tehnologie permite, spre exemplu, varianta de autotranst medular, la pacienti cu forme dirse de neoplazii ale tesuturilor hemato-
poietice. Citometria permite selectia exclusiva a celulelor ce poarta setul de antigene corespunzatoare celulelor
stern sanatoase.
Ce inseamna microscopie de forta atomica?
Puterea de rezolutie a microscopiei optice clasice este limitata de lungimea de unda a luminii vizibile. De aceea, microscopia de forta atomica utilizeaza un alt principiu. Instrumentul masoara topografia de suprafata a probei de examinat, iar informatiile sunt colectate cu o sonda de suprafata (asemanatoare unui ac foarte subtire) (in Ib. engleza cantiler). Adeseori este evocata asemanarea cu un pick-up. Varful acestui "ac\" (fabricat de obicei dintr-o sare siliconica), baleiaza pe suprafata probei. Interactiunile dintre ac si proba examinata sunt de ordinul a 1 nN si atribuite fortelor van der Waals (fortele atomice sunt si cele ce au inspirat denumirea acestui tip de microscopie). Ele sunt masurate cu ajutorul deflectiei pe care deplasarea acului o determina asupra unui fascicul laser ce este proiectat pe fata sa externa. Un sistem de feed-back controleaza distanta dintre proba examinata si ac, mentinand-o constanta (89). Acest tip de microscopie ofera informatii asupra suprafetelor ADN-ului, ale cromozomilor, ale fibrilelor de colagen, permite examenul membranelor plasmatice in vivo, al porilor inlisului nuclear, al unor sectiuni ale celulelor sau tesuturilor, fara o includere prealabila (64, 82, 89).
