Ce este cultura celulara? Cum arata o celula normala? Cum se recunosc celulele tumorale?
Celulele organismelor superioare au capacitatea de a creste atasate de fundul de material palstic al vaselor Petri atunci cand li se furnizeaza un mediu continand hrana si factori de crestere precum si o atmosfera bogata in dioxid de carbon, astfel incat ele sa aiba impresia ca sunt in interiorul organismului. Celulele normale (denumite suse) au capacitatea de a se divide de 50-l00 de ori inainte de a pieri si limitarea numarului de diviziuni celulare pare a fi unul dintre motivele pentru care nu suntem imortali. Limitarea numarului de diviziuni celulare se datoreaza scurtarii succesive a extremitatilor cromozomilor, extremitati numite telomeri, din cauza saracirii enzimei numita telomerctza. care ar trebui sa vegheze la mentinerea lungimii corecte. m pomeni despre aceasta enzima mai incolo.
Cuprins:
Celule normale şi celule tumorale în cultură |
sus  |
O celulă canceroasă este nemuritoare. O celulă imortală realizează o linie celulară: ea este nemuritoare în sensul că poate să se dividă la infinit Evident, în acest caz, telomeraza nu i se împuţinează pe parcurs. Vom vedea mai jos că suşele celulare pot fi covertite în linii celulare prin transfectare cu viruşi, cu material genetic de la o altă celulă tumorală, prin iradiere, sau cu agenţi mutageni.
In Fig. 5.1 e prezentată imaginea a două tipuri de celule cultivate în laborator: fibroblaşti de şoarece, adică, celule "normale" de piele, denumite şi cellule ale lui Dunni (A) şi celule umane HeLa (B). Ambele sunt linii celulare, prima devenind imortală în urma unui "accident".
Celulele HeLa provin dintr-un carcinom cervical al unei paciente decedată în 1951, numită Henrietta Lacks (care a dat numele liniei), ale cărei celule tumorale continuă să-i supravieţuiască în toate laboratoarele.
lumii. Dacă "lemnul crucii" de la Ierusalim expus în toate bisericile, sau fragmentele din "osul lui Bouddha" adăpostit în toate pagodele s-ar aduna grămadă, ar face poate nişte movile cât un deal. Cum celulele HeLa se divid de mai multe ori pe săptămână, dacă n-ar fi decimate săptămânal, ar realiza, poate şi ele o grămdă cât un munte!
Cultivate in vitro (în laborator), celulele tumorale se disting de cele normale prin următoarele caracteristici:
. celulele normale se dezvoltă sub forma unui strat monocelular, iar celulele tumorale creează straturi multiple;
. celulele normale suferă o "inhibiţie de contact" atunci când întâlnesc vecinătatea altora şi se opresc din creştere, dar cele canceroase continuă să se dividă;
. celulele normale nu pot creşte fără a li se furniza factori de creştere, administrat de regulă sub forma a 10% serum sanghin (sau chiar serum fetal, mult mai bogat în factori de creştere), dar celulele tumorale ajung să-şi secreteze singure aceşti factori;
. celulele normale nu pot creşte în suspensie (de exemplu în agar moale), în timp ce se pot obţine colonii de celule canceroase suspendate în agar,
. celulele canceroase secretează cantităţi sporite de proteaze (enzime hi-drolitice de care se servesc pentru "a-şi face Ioc" în ţesutul din jur), au, graţie conţinutului diferit de glicoproteine şi glicolipide, membrane celulare mai fluide decât celulele normale, au capacitatea de a "absorbi" cantitatăţi mai mari de glucoza din mediu (ca să se hrănească) şi secretă mai puţin colagen şi fibronectină (care le-ar împiedeca să metastazeze).
Alterarea secvenţei de baze în ADN-ul unei gene constituie o mutaţie. Dacă mutaţia e localizată în porţiunea noncodantă a genei (de exemplu, în promotor), va fi probabil afectat modul în care aceasta va fi transcrisă. Dacă mesajul genetic este alterat chiar în porţiunea codantă, secvenţa de aminoacizi din proteină va fi diferită. înlocuirea (substituţia) unei singure baze va afecta un singur triplet şi deci va conduce la schimbarea unui singur aminoacid în proteină. Această proteină va fi probabil funcţională dar activitatea sa va fi diferită de cea a proteinei native. E cazul cel mai frecvent întâlnit printre proteinele asociate cu cancerul. Alte tipuri de mutaţii, ilustrate în Fig. 5.2, precum deleţia sau adiţia, vor "falsifica" tot restul mesajului genetic şi proteina rezultantă va fi profund diferită de cea "nativă", poate complet neviabilă.
Există cazuri de reorganizare masivă a materialului genetic, de exemplu prin ruperea şi sudarea a doi cromozomi diferiţi. Este posibil ca "genei" rezultate prin sudarea a două fragmente de genă la nivelul rupturii cromozomului să-i corespundă o "neoproteină" cu funcţionalităţi nebănuite. Despre acest caz, care nu este deloc rar, vom mai discuta.
Apariţia mutaţiilor e un fenomen natural aleator, care se produce cu o anumită frecvenţă în momentul replicării ADN-ului şi pe care celula ştie să îl contracareze într-o oarecare măsură (să ne amintim, de pildă, că ADN-ul e constituit din două lanţuri complementare şi că, modificând doar pe unul dintre ele, rămâne al doilea, de pe matricea căruia eroarea ar putea ti, în principiu, corectată). Factorii cancerigeni (radiaţia, substanţele chimice) creează astfel de mutaţii în exces, iar unele dintre ele nu mai ajung să fie corectate.
Producerea unei mutaţii în mesajul genetic al unor anumite gene este primul pas în direcţia apariţiei cancerului. Aceste gene, susceptibile să cauzeze cancerul în urma mutaţiilor, sunt de trei feluri:
- oncogene;
- gene supresoare de tumori;
- gene implicate în repararea ADN-ului.
Să vedem cum s-a ajuns la identificarea acestor trei categorii de gene şi care este rolul lor.
Protooncogenele
Viruşii tumorigeni şi oncogenlee virale
Prima sugestie că apariţia tumorilor se datorefte transmisiei de material genetic provenit de la o altă celulă aparţine lui Peyton Rous, care, în 1911, observă că sarcoamele pot fi provocate la găină cu un filtrat "lipsit de celule", conţinînd virusul care-i poartă numele.
Prin anii 1970 s-a ştiut că dintre cele câteva gene aparţinând virusului, doar una era răspunzătoare de cancer. Această oncogenă a fost denumită Src (de la cuvântul sarcom).
Anul 1981 a venit cu surpriza că toate celulele normale (la om sau la găină!) conţin o variantă (necangerigenă, nemutantă) a acestei gene, care a fost numită c-Src. Prefixul "c" înseamnă genă "celulară" normală, spre a o deosebi de cea virală (cărei i se poate atribui prefixul v, de exemplu v-Src). Această genă celulară face parte dintr-o familie de gene care urmau să fie identificate ulterior: protooncogenele, adică gene cu potenţial oncogen.
Ulterior au fost descoperite şi alţi viruşi tumorigeni. Despre unii dintre ei am pomenit deja.
Mutagenicitatea |
sus |
Majoritatea tumorilor nu sunt însă datorate virusurilor. Bruce Ames, autorul testului bacterian de mutagenicitate, constată că majoritatea factorilor răspunzători de cancer (atât produsele cancerigene cât şi radiaţiile) sunt şi factori mutageni. Se emite şi confirmă ipoteza că mutaţiile apărute în anumite gene normale ar putea să le convertească pe acestea în oncogene.
Vom descrie mai jos testul lui Ames, nu pentru că ar fi esenţial înţelegerii naturii oncogenelor, nici pentru că l-am cunoscut personal pe autor, ci pentru că ne permite să ne familiarizăm cu "viteza" cu care se produc mutaţiile în lumea microbiologiei .
Se utilizează o variantă a bacteriei Salmonella typhimurium, incapabilă să crească fără suplimentare de histidină în mediul de cultură, pentru că gena care codifică enzima esenţială în producerea histidinei este mutantă.
Există probabilitatea ca un agent mutagen să cauzeze, între altele şi o reversie ("mutaţie a mutaţiei"), astfel că genomul bacteriei să revină Ia normal, iar bacteria să poată creşte şi fără histidină. Suspensia bacterianâ este etalată în lipsa histidinei pe stratul de agar din vasul Petri din Fig. 5.3. Micul disc de carton din centrul plăcii este impregnat cu substanţa presupusă mutagenă, care difuzează în agar.
Acele bacterii care au revenit la normal în urma contactului cu mutagenul vor dezvolta colonii (vizibile în preajma discului). Cu cât numărul de colonii este mai mare, cu atât substanţa este mai mutagenă.
Este util de remarcat că există colonii şi la periferia vasului. Acestea se datorează mutaţiilor spontane. Deşi probabilitatea unei mutaţii spontane este infimă, faptul că se utilizează milioane de bacterii simultan, care sunt capabile să se dividă de mai multe ori pe oră, face ca şi o probabilitate infimă să devină observabilă!
încă un detaliu: majoritatea substanţelor cancerigene nu sunt mutagene directe. Unele dintre ele trebuiesc "activate" pe cale metabolică. Pentru acest motiv, testul lui Ames se efectuează în prezenţa unui extract de ficat, care furnizează enzimele necesare.
De exemplu, benzo-a-pirenul este un mutagen indirect. Pentru ca să devină activ, ele este convertit într-un epoxid de către citocromul P450 prezent în ficat. Din contră, metil-nitroso ureea este un mutagen direct. Ea atacă direct molecula de ADN.
Cu testul lui Ames, în ciuda simplităţii şi limitelor sale, au fost identificate majoritatea substanţelor cancerigene care au făcut senzaţie la vremea respectivă: di-bromura de etilen, care se punea în benzină, ziram-u\\, folosit ca pesticid, isoniazidul, folosit ca medicament antituberculos, sq/rolul, folosit la fabricarea berii, qflatoxinele din grânele mucezite, precum şi 9 ingrediente diferite, prezente în hamburgerul american! Zaharina nu este mutagenă, cel puţin conform acestui test! In schimb, nu apare mutagenă nici dioxina, despre care se ştie că este un puternic cancerigen!
Oncogenele celulare |
sus |
în 1978 Robert Weinberg arată că oncogenele sunt prezente şi în tumorile de origine non-virală. Oncogenele iau naştere prin conversia unei gene normale (protooncogena) în urma unei mutaţii. Formarea unei tumori este iniţiată prin apariţia unei oncogene într-o (singură) celulă. Oncogenele care ajung în organism drept rezultat al unei infecţii virale sunt răspunzătoare de puţine dintre cancere. Majoritatea cancerelor se datorează însă unor mutaţii în gene celulare.
Faptul că apariţia cancerului se datorează exprimării unor oncogene celulare a fost demonstrat prin experienţe de transfecţie genică de felul celei descrise în Fig. 5.4. ADN-ul izolat din celule tumorale a fost transfectat în celule în cultură. La acea epocă, se cultivau cu precădere fibroblaşti de şoarece, iar materialul genetic eratransfectat prin precipitarea acestuia cu fosfat de calciu şi adăugarea lui la mediul de cultură. Procentajul de celule care "preiau" materialul genetic este infim, dar, după ce am văzut cum decurg lucrurile în lumea celulelor, nu trebuie să ne mai mirăm (re-vezi Fig. 5-3). O singură celulă transformată este suficientă pentru a creea un clon.
Celula transfectată cu material genetic cancerigen "se transformă", devine tumorală. Ca dovadă, prin injectarea la şoarece, ea se dezvoltă sub forma unei tumori.
îndrăznesc să intervin aici cu o experienţă personală. Am transfectat şi eu celule umane MCF7, provenind dintr-un cancer de sân, cu o construcţie proprie, realizată după cum urmează.
. Pe de o parte, am fiizionat într-o plasmidă promotorul genei HBR2 (sau Neu, sau c-ErbB-2, genă "asociată" cu cancerul de sân) la gena care codifică luciferaza (enzima răspunzătoare de emisia de lumină de către licurici), ideea fiind că atunci cînd e prezent semnalul care lansează transcrierea genei HER2, va fi transcrisă şi gena luciferazei.
. Pe de altă parte, o altă plasmidă conţinea gena care dădea rezistenţă la un antibiotic (codând pentru enzima care îl inactivează). Am transfectat simultan cele două plasimide în celulele MCF7. Transfectarea modernă se mai poate face prin electroporaţie (se permeabilizeazâ temporar membrana celulară printr-o descărcare electrică) sau vectorizat, cu ajutorul lipozomilor, dar eu am utilizat calea clasică, cu fosfat de calciu.
Plasmidă purtătoare a genei de rezistenţă la antibiotic era în minoritate faţă de cealaltă printr-un factor de 20.
. Celulele au fost menţinute în mediu de antibiotic câteva săptămâni, după care am recoltat un număr de clonuri devenite rezistente. Cum plasmidă dătătoare de rezistenţă la antibiotic era în minoritate, era probabil că unele dintre clonurile rezistente la antibiotic, care incorporaseră gena de rezistenţă, să fi incorporat şi plasmidă cu construcţia HER2-luciferază. într-adevăr, când li se furniza luciferină, celulele pe care le-am obţinut mai sus emiteau lumină ca şi licuricii, însă doar atâta vreme cât sintetizau proteina HER2.
. Când am reuşit să inhib acesată genă (ceea ce voi descrie într-un capitol viitor), deci când "am tratat" celulele canceroase, acestea au încetat să mai fie luminescente.
Rolul oncogenelor |
sus |
Majoritatea protooncogenelor codifică în celula normală proteine implicate în creşterea şi diferenţierea celulelor, fie că acestea ar fi factori de creştere, receptori de factori de creştere membranari, componente ale căilor de semnalizare intra-celulară, inclusiv factori de transcriere. Mutaţiile la nivelul genelor afectează secvenţa de aminoacizi ai acestor proteine, cu efecte asupra structurii, eventual a concentraţiei şi implicit a activităţii acestora. Ea se răsfrânge în comportamentul aberant al celulei canceroase. Nu-i de mirare că şansa de a face cancer creşte cu vârsta, căci tot odată cu vârsta cresc şansele de a contracta noi mutaţii în secvenţa protooncogenelor.
în înţeles restrâns, o oncogenă (spre deosebire de un alt tip de genă mutantă, gena supresoare de tumori, sau antioncogena, despre care vom vorbi mai jos) este o genă a cărei EXPRIMARE conduce la proteine care stimulează procesul cancerogenezei: exprimarea protooncogenei (a genei normale) conduce la o proteină cu rol de regulator al creşterii celulei; exprimarea oncogenei (a variantei mutante a protooncogenei) accelerează viteza de creştere şi diviziune a celulei (Fig. 5.5). "Accelerarea" fiecărei etape descrisă în figură se datorează câte unei mutaţii suplimentare, activării unei noi oncogene.
în mod experimental e suficient uneori să se injecteze în celulă produsul unei oncogene (oncoproteina) pentru a cauza transformarea acesteaia. De regulă, celula se transfecteză, însă, cu o plasmidă conţinând oncogenă în cauză, aflată sub controlul unui promotor care poate fi "declanşat" din exterior. Activarea promotorului coincide cu o transformare temporară a celulei.
lată câteva tipuri de oncogene şi exemple de oncoproteine din fiecare tip. Ultimele două linii din tabel se referă la genele supresoare de tumori şi genele implicate în repararea ADN-ului, despre care se va vorbi în continuare.
Tipul de oncogenă
F.xemple de oncoproteine
Factori de creştere (.growth factors"): iniţiază diviziunea celulară
Receptori de factori de creştere: mutaţia i-a determinat să se menţină activi în mod permanent (în mod "constitutiv") Transductori intracelulari: modifică lanţul de semnalizare (de ex. al AMP-ului ciclic) menţinându-l permanent activ
Factori nucleari de transcriere: afectează viteza de transcriere a anumitor gene
Gene supreseoare de tumori
Gene de reparare a ADN-ului
. EGF "Epiderma! growth factor": stimulează un receptor membranar (EGFR).
. PDGF ,flatelel-derived growth factor": produsul genei Sis ("simian sarcoma") este secretat de plachetele sanghine în buclă autocrină.
. TGF "Transforming growth factor": stimulează în buclă autocrină acelaşi receptor EGFR
. ErbA: este un receptor intracelular al hormonului tiroidian
. ErbB: este o versiune truncată a EGFR.
. neu (.jieurohlastoma"): este un echivalent mutant al EGFR.
. Crk o proteină fără rol enzimatic. cu domenii SH2 şi SHj, apte de interacţiune cu alte proteine generatoare de mesageri secundari.
. Mos: o protein-kinază care fosforileză serinele sau treoninele.
. Ras: proteină asociată cu receptorii membranari, cu activitate de GTP-ază.
. Src. protein-kinază care fosforilează tirozinele.
. Fos: proteina se fixează pe promotorul AP-I. Răspunde rapid la stimularea prin ser, iar ARN-ul mesager se degradează tot aşa de repede.
. Jun: se fixează pe ADN sub formă de homodimer, sau de heterodimer împreună cu proteina Fos.
. Myc (..myelocyiomatosis"): factor de transcripţie.
. ciclinele (de ex. cdc2) şi alte protein-kinaze: asigură "punctele de control" ale ciclului celular
. p53: proteina nativă menţine celulele in faza G, până ce ADN-ul defect este reparat.
. pRb ("Retinoblastoma"): implicată în ciclul celular
. ex.:proteina răspunzătoare de excizia dimerilor de timină, absentă în xeroderma pigmentosum
Rolul genelor supresoare de tumori |
sus |
O genă supresoare de tumori normală trece neobservată. Ceea ce devine observabilă şi conduce la cancer este ABSENŢA acesteia. Moştenirea riscului de cancer se poate datora, între altele, faptului că individul ar fi primit de la părinţi doar una dintre gene normală, cealaltă fiind defectuoasă. în acest caz, orice mutaţie ia gena validă privează celula de funcţia amândurora.
Rolul genelor supresoare de tumori este acela de a impune celulelor temperanţa.
O celulă purtând o oncogenă este ca o locomotivă care rulează cu presiunea aburului la mximum; o celulă lipsită de o genă supresoare de tumori este ca o locomotivă căreia îi lipsesc frânele. E posibil ca o genă supresoare de tumori mutantă să să fie prezentă la modul recesiv în toate celulele organismului, datorită unei moşteniri defectuoase. Este însă greu de imaginat acelaşi lucru în cazul unei oncogene, care acţionează la modul dominant. Pentru aceasta, ar trebui ca oncogenă (mutantă) să fi fost prezentă în linia germinală şi să fi însoţit embrionul, anonimă, pe tot parcursul dezvoltării sale, fără a-i fi fost letală. Excepţii există, însă şi au fost deja menţionate.
Rolul proteinei p53 în declanşarea apoptozei
Despre cazul ciclinelor, care sunt produşii unor gene supresoare de tumori, s-a vorbit în capitolul precedent. O genă supresoare de tumori de maximă importanţă este cea răspunzătoare de proteina p53. Această proteină se sesizează de prezenţa unor defecte în structura ADN-ului şi impune oprirea ciclului celular până ce toate reparaţiile au fost efectuate. In cazul în care starea ADN-ului este deplorabilă şi nu mai poate fi reparat, ea declanşează apoptoza.
Apoptoza, sau moartea programată, începe cu fragmentarea ADN-ului, după care membrana celulară se bulbucă şi se destramă în numeroase bule, care sunt apoi fagogitate de către celulele vecine. De pe urma apoptozei. materia vie nu se risipeşte, ci este recuperată. Nu trebuie confitndată apoptoza cu necroza, care este o rupere brutală a membranei urmată de vărsarea conţinutului celular în mediul exterior.
Mai toate tumorile achiziţionează, în ultimele stadii ale dezvoltării lor, mutante ale proteinei p53.
Anticipăm faptul că printre moleculele implicate în apoptoză se mai numără două categorii de proteine cu rol de gardian, care-şi fac echilibrul:
- caspazele, care cliveazâ anumite proteine, activându-le,
- proteina Bcl-2, analogul ei Bcl-xL şi inhibitorul IAP {"inhibitor qfapoptosisprotein"), care se opun celor dintâi.
în multe tumori refractare la terapiile standard, proteinele Bcl-2, Bcl-xL şi IAP sunt intens supraexprimate.
Genele de reparare a ADN-ului
Am remarcat în legătură cu testul laui Ames că mutaţii se produc tot timpul chiar şi neprovocate din exterior, datorită naturii însăşi a proceselor biologice. Dacă ar fi să ne păzim de cancer, ar trebui să încercăm pe toate căile să nu adăugăm mutaţii suplimentare la cele care oricum trebuie să le înfruntăm.
Celula posedă mecanisme multiple de reparare a defectelor de incorporare a nucleotidelor în ADN sau ARN. Funcţionarea defectuoasă a acestor mecanisme poate lăsa să apară şi să se perpetueze mutaţii în secvenţele oncogeneior sau ale genelor supresoare de tumori, cu consecinţe imaginabile.
De exemplu, un anumit cancer de colon este cauzat de o deficienţă în repararea ADN-ului.
Unele deficienţele ale genelor implicate în repararea ADN-ului pot constitui caractere transmise ereditar. Aşa este, de exemplu, cazul bolii denumite xeroderma pigmentosum, datorată faptului că celula nu poate exciza şi înlocui dimerii de timină care iau naştere sub influenţa radiaţiilor ultraviolete. Aviz amatorilor de plaje: nici chiar organismul sănătos nu poate lupta cu dimerii de timină dacă sunt prea numeroşi!
Progresia cancerului
Putem da acum un înţeles la nivel molecular etapelor procesului de cancerogeneză, descris deja într-unui din capitolele precedente (Fig. 5.6):
1. Iniţierea. O primă celulă este modificată genetic. Mutaţia o determină sâ prolifereze, în Ioc să rămână în stare de non-di viziune.
2. Hiperplazia. Celulele, care păstrează încă aspectul normal, continuă să se dividă prea repede. Una dintre ele va achiziţiona o nouă mutaţie.
3. Dispalzia. Proliferarea celulară devine anormală, haotică. Una dintre celule mai achiziţionează o mutaţie.
4. Cancer in situ. Tumoarea creşte regrupată, fără să depăşească zona de ţesut în care a fost iniţiată.
5. Cancer invaziv. O nouă mutaţie transmite celulei potenţialul de a migra în organism. Tumorile ajung să conţină până la 6-8 mutaţii diferite. Vom vedea mai încolo că numărul minim ar fi vreo 3-4.
Cum ar trebui să fie concepută terapia antitumorală moleculară
Detectarea cancerului
Din moment ce cancerul este iniţiat printr-o mutaţie şi progresează acumulând noi mutaţii, ar fi logic ca acesta sâ poată fi detectat şi evaluat prin teste sensibile, care să pună în evidenţă tocmai existenţa şi numărul acestora. Procedeul de detectare ar putea fi dirijat spre ADN, sau, de ce nu, spre proteina mutantă care rezultă, sau spre vreo proteină specifică celulei canceroase. Cazul (controversat, de altfel) al antigenului specific de prostată (PSA) se încadrează în ultima categorie.
Odată cu progresele realizate în secvenţarea genomului uman şi a tehnologiilor de mare randament şi precizie dezvoltate cu acest prilej, e posibilă monitorizarea fie a secvenţei mai multor gene deodată, fie identificarea şi cuantificarea moleculelor de ARN mesager existente la un moment dat, fie măsurarea simultană a prezenţei şi a concentraţiei mai multor proteine. Viitorul apropiat va aduce mari schimbări în acest sens, atît în ce priveşte înţelegerea globală a înlănţuirii proceselor moleculare din celula canceroasă, cât şi în detectarea cancerului.
Tratamentul cancerului
După parcurgerea informaţiilor de până acum, e uşor de remarcat faptul că metodele "convenţionale" de tratament ale cancerului, enumerate în primul capitol, mai puţin chirurgia, nu vizează, de fapt, "tumoarea", ci celulele aflate în diviziune rapidă! într-adevăr, prin iradiere, sau prin chimioterapie, se încearcă a ţinti câte o etapă a replicării ADN-ului sau a diviziunii celulare, preferabil impunând celulelor afectate să declanşeze propria lor moarte. Acesta a fost cazul descris al antraciclinelor şi tot aşa ne imaginăm că ar funcţiona şi radioterapia. Chimioterapia are rolul de a preveni recurenţa cancerului în zone distante, în timp ce radioterapia ar preveni recurenţa locală.
Răspunsul celulelor iradiate la agresiune ar implica declanşarea unor mecanisme de reparare a ADN-ului şi activarea punctelor de control ale ciclului celular, urmând ca celulele afectate să fie sau eliminate, sau complet reconstituite. Unele chimioterapice, precum cis-platimd şi bleomicina, acţionează oarecum la fel ca radiaţia, pentru că produc rupturi ale ADN-ului prin mecanisme implicând radicali liberi.
Există două tipuri de moarte celulară indusă de ruperea cromozomilor: moartea "mitotică" şi apoptoza.
- Apoptoza este rezultatul unei "decizii" luată în "cunoştinţă de cauză" de către o celulă, aş zice, normală.
- Moartea mitotică survine atunci când celulele, care nu au reuşit să-şi repare corect ADN-ul, continuă totuşi să se dividă până ce se "incurcă" printre atâtea fragmente de cromozomi, pe care nu reuşesc să îi partajeze echitabil între celulele-fiice. Este ceea ce se întâmplă cel mai adesea cu celulele canceroase care au fost supuse iradierii.
Este interesat de remarcat faptul că în repararea rupturilor produse în ADN par a fi implicate două gene asociate cu cancerul de sân, BRCA1 şi BRCA2. Nivelul proteinelor care corespund acestor gene este co-modulat pe parcursul ciclului celular şi le găsim asociate cu proteina RAD51 (echivalentul eucariotic al enzimei de recombinare la bacterii, RecA), care e implicată în menţinerea şi restabilirea integrităţii cromozom iale.
Chimioterapiei şi radioterapiei le lipseşte specificitatea. Vor suferi şi celulele care trebuie şi continuă să prolifereze şi în organismul sănătos: celulele foliculilor capilari, ale pereţilor intestinelor, ale măduvii osoase. Efectele secundare ale tratamentului convenţional (pierdera părului, greaţa, anemia sau depresia imunitară) sunt datorate tocmai inteferenţei cu celulele respective!
Dacă ar fi să ne exprimăm printr-o imagine, metodele convenţionale tratează partea vizibilă a unui aisberg, cu "acurateţea" şi forţa de nimicire a marilor mijloace (Fig. 5.7)!
Terapia viitorului trebuie să vizeze ţinte specifice: fie o anumită oncogenă sau produsul acesteia, fie o enzimă-cheie care să ţină în şah diviziunea celulară. Câteva asemenea enzime (dintre care unele joacă roluri-cheie în procesul de cancerogenezâ) au fost sugerate deja în capitolele precedente, iar unele dintre ele vor fi reluate în capitolul următor.
în prezent se caută căile de "renormalizare" a genelor răspunzătoare de tumori în interiorul tumorii însăşi. Se caută a se identifica profilui genetic al tumorii, pentru a se interveni în cunoştinţă de cauză, la timp şi eficient Fiecare pacient canceros este însă un caz unic. Fiecare caz unic răspunde la o terapie adaptată unicităţii cazului.
Aş putea zice că e posibil în principiu, astăzi, să înţelegem, ca să tratăm, orice cancer, dar nu în timp util. Fiecare caz este ca o nouă temă de cercetare ştiinţifică. Viitorul trebuie să aducă rezultatul cercetărilor fundamentale în serviciul imediat al bolnavilor.
Ce ne aduce viitorul?
. Se va putea, oare, "restitui" o genă supresoare de tumori?
. Se va putea inhiba expresia unei anumite oncogene? In acest caz nu se mai pune problema restituirii protooncogenei (nemutante) ci, dimpotrivă, se speră că, în lipsa ei, celula va trece la moarte programată.
. Se vor putea reversa potenţialul de metastazare şi de nemurire a celulelor canceroase? înseamnă, oare, că în acest caz, vom şti să împiedicăm şi îmbătrânirea?
. Se va identifica factorul genetic de predispoziţie la cancer, care face ca unii, care au dus o viaţă de sfinţi, să aibă cancer, în timp ce alţii, care ,.şi-au bătut joc" de viaţă şi de propriul lor organism, nu au nimic?
. Se va putea trata "pacientul" şi nu, în mod global, cancerul acestuia? Adică, întrucât un medicament poate da rezultate excelente într-o treime din cazuri şi nu în celelalte, se va identifica profilul genetic al tumorii care face din fiecare medicament o unelată 100% eficace?
Răspunsul la aceste întebări, în ce priveşte cancerul, (Fig. 5.8) este încurajator şi afirmativ. Doar în cazul îmbătrânirii trebuie pus un bemol: îmbătrânirea se datorează uzurii celulelor. Organismul nu are un mecanism de "îmbătrânire programată\'", tot aşa cum nici o maşină nu are un mecanism predestinat de îmbătrânire. Şi totuşi, nici o maşină nu funcţionează la nesfârşit: mai devreme sau mai târziu, va sucomba uzurii!
De ce suntem optimişti |
sus |
Dacă astăzi suntem optimişti în privinţa faptului că cercetarea ştiinţifică va reuşi să pună la îndemâna noastră mijloace eficiente de lupă contra cancerului este pentru că avem tot mai mult confirmarea corectitudinii ipotezelor emise în ultimele decenii.
Un pas important în acest sens a fost furnizat, în parte, de către o experienţă realizată (tot) în laboratorul lui Robert Weinberg, în 1999. Să pregătim terenul spre a o aborda.
Teiomerii şi moartea celulei
Cu ani în urmă. Barbara McCIintock descoperea teiomerii şi sugera că aceştia ar proteja cromozomii împotriva fuzionării lor nelegitime. De atunci s-au scurs peste 60 de ani. Acum se ştie că telomerul, secvenţa repetată de sute de ori la extremităţile cromozomilor, are o structură complexă, ADN-ul complexând un număr de proteine, al căror rol este menţinerea lungimii acestuia în limite optime. Se mai ştie că telomerul ar juca şi rolul de "numărător" molecular al diviziunilor celulelor, pentru a le împiedica să prolifereze la nesfârşit. Poate tocmai pentru a ne proteja de cancer.
Celulele canceroase sunt imortale. Ele au învins mecanismele moleculare cu rol de stavilă împotriva multiplicării lor infinite. Cum au ajuns la această performanţă nu se ştie încă în detaliu, dar în linii mari procesul ar fi următorul.
Senescenţa şi criza
Celulele umane, ca să prolifereze nelimitat, au de depăşit două bariere. Prima dintre ele este pragul de senscenţă, de îmbătrânire.
Senescenţa" este starea fenotipică "de ultimă instanţă" adoptată de celulă drept răspuns la o serie de procese fiziologice, precum proliferarea, activarea de oncogene, sau eroziunea prin radicali liberi. Minimum două gene supresoare de tumori sunt implicate în menţinerea acestei bariere şi anume cele răpunzătoare de proteinele p53 şi pRb (Rb, ,Ţetinoblastomd\'\\ Am văzut deja care ar fi rolul acestora în controlul "de calitate" al ADN-ului şi al încheierii corecte a unei anumite etape a ciclului celular.
Fibroblaştii umani normali, menţinuţi în cultură celulară, se divid de vreo 50-80 de ori înainte de a atinge stadiul de senescenţa. Transformarea acestor celule prin transfectarea cu anumite oncogene virale, precum "marele antigen T" al virusului SV40 (SV, simian virus", virus de maimuţă) conduce la depăşirea blocajului. Se apre câ antigenul inactivează tocmai proteinele p53 şi pRB.
Inactivarea acestor proteine ridică bariera proliferativă şi permite o oarcare prelungire a vieţii celulei, fără ca aceasta să devină, deocamdată, imortală. într-adevăr, pe măsură ce o celulă normală se supune unor diviziuni repetate, telomerii se scurtează la fiecare ciclu replicativ al ADN-ului, datorită incapacităţii ADN-polimerazei de a replica corect extremităţile cromozomilor. Scurtarea telomerilor continuă până la atingerea unui al doilea moment de blocaj proliferativ, denumit ,Łriză". De pildă, după depăşirea primului blocaj, fibroblaştii în cultură se mai divid de 20-30 de ori.
Starea de criză este caracterizată prin instabilitate cromozomială, fuzionare cap-la-cap a cromozomilor şi, eventual, moarte celulară.
Criza poate fi însă depăşită prin activarea sau a unei enzime, telomeraza, sau a unui al doilea mecanism, zis alternativ (ALT), de restabilire a integrităţii telomerului. Celula devine astfel imortală.
Telomeraza (hTERT: ,Jruman telomere reverse transcriptase") este o ribonucleoproteină, o enzimă constituită din proteină plus ARN. Proteina este o revers-transcriptază.
In mod aparent neaşteptat regăsim acest tip de proteină în centrul atenţiei în legătură cu o altă maladie gravă şi spectaculoasă: SIDA. Genomul virusului Sidei este alcătuit din două molecule de ARN. Prima elapă a ciclului de proliferare retrovirală, imediat după pătrunderea virusului în celula umană, este revers-transcrierea secvenţei de baze ale ARN-ului într-o secvenţă de ADN. Acest rol este îndeplinit de către revers-transcriptaza virală. ADN-ul proviral este apoi "integrat" în genomul uman (graţie enzimei Jntegrază\'), de unde se va comporta apoi ca şi cum ar fi o genă proprie a celulei. Va "dormita" un timp, după care va lansa transcrierea propriului său bagaj genetic.
Am făcut această digresiune pentru a arăta că, la nivel molecular, toate căile se întâlnesc. Cercetarea ştiinţifică care s-a concentrat asupra Sidei a făcut lumină în numeroase domenii ale cancerologiei şi invers.
Telomeraza umană (produsul genei hTERT) poartă cu sine fragmentul de ARN (TR, Jelomerase RNA") pe care îl revers-transcrie "la infinit" sub forma unei secvenţe hexamerice repetate de ADN, pe care o adaugă la cromozom:
TTAAGG.
Rolul acesteia este compensarea pierderii progresive de material teiomeric de la capetele cromozomilor la fiecare replicare.
In mod normal, în celulele somatice umane gena hTERT este reprimată (silenţioasă): nivelul telomerazei este minim sau inexistent Din contră, în majoritatea celulelor tumorale în cultură (în 80-90% din cazuri) telomeraza este prezentă. Telomeraza este prezentă, ca urmare a unei activări spontane, "accidentale", a exprimării genei respective şi în rarele cazuri când celule normale, menţinute în cultură, reuşesc să depăşească momentul de "criză".
Se crede că, în context natural, gena hTERT este activată de către oncogena c-Myc.
Exprimarea genei Myc este adesea dereglată în tumori şi n-ar fi exclus ca imortalizarea celulelor tumorale prin exprimarea
telomerazei să fie legată de supraexpnmarea genei Myc. Vom mai pomeni această genă în legătură cu cancerul de sân.
S-au făcut numeroase experinţe vizând telomeraza atât pe celule în cultură, cât şi pe animal:
. S-a arătat, de pildă, că prin exprimarea în celulele tumorale în cultură a unei telomeraze mutante, inactive, telomerii s-au scurtat progresiv, iar celulele au murit.
. Mai mult decât atât, prin transfectarea aceleaşi gene mutante unei tumori in vivo, tumoarea a regresat.
. Invers, exprimarea ectopică a telomerazei în celule post-senes-cente Ie-a permis acestora să-şi reia creşterea şi să prolifereze nelimitat
Ne este clar, după cele spuse mai sus, că progresia unei tumori e limitată la început de numărul de cicluri replicative aflat la dispoziţia celulelor respective. Celulele în stadiu premalign riscă să-şi nu-şi completeze "programul" de malignitate, spre norocul celui care ar urma să facă un cancer. Vor ajunge la cancer doar acele celule tumorale care au reuşit, pe o cale oarecare, să depăşească şi blocajul telomerazei, ca să devină imortale.
O experienţă majoră: creerea de celule tumorale cu un conţinut oncogenic predefinit |
sus |
Se ştia de mai demult transforma în celule canceroase o linie celulară (imortalizată), dar nu o suşă de celule umane normale. Obstacolul îl constituia tocmai gena hTERT, codând enzima telomeraza. în celulele normale, ea nu este activă, iar telomerii sunt "scurtaţi" la lungimea minimă compatibilă cu supravieţuirea celulei. (Cu titlu anectodic, amintim că oaia Dolly, obţinută prin clonaj, s-a născut "bătrână", de vârsta "mamei", căci telomerii uneia şi alteia aveau aceeaşi lungime! Ucenicii-vrăjitori au învăţat între timp, însă, să nască clone "întinerite", "umblând" tocmai la enzima telomeraza.)
Echipa dirijată de Wiliiam Hahn a reuşit, în laboratorul aceluiaşi Robert Weinberg, despre care am mai pomenit să creze pornind de la o celulă umană normală, o celulă canceroasă cu conţinut oncogenic predefinit Este o performanţă care reprezintă un mare pas înainte în înţelegerea originii cancerului şi a progresiei acestuia. într-o serie de etape, aşa cum se întâmplă şi în mod spontan, au fost introduse în celulă, pe rând, un număr de trei gene. Trei gene au fost de ajuns: T, Ras şi hTERT.
Să urmărim progresia procesului de malignizare, pe fundalul aceleaşi diagrame pe care am utilizat-o cu câteva capitole în urmă (Fig. 5.9):
. începem cu o celulă normală, al cărei proces de înbătrânire este supravegheat de prezenţa celor doi gardieni ai ciclului celular, proteinele p53 şi pRb (etapa 1).
. Introducem apoi (prin transfectarea în celulă a plasmidei purtând gena respectivă) antigenul T al virusului SV40, care inactivează cele două proteine. Prima barieră în calea imortalizării este îndepărtată (etapa 2).
. Urmează apoi transfectarea genei H-Ras, reprezentând o variantă oncogenică mutantă a proteinei membranare Ras, despre care am mai vorbit. Celula e acum dotată cu un potenţial proliferativ (etapa
. în fine, este introdusă acum cu ajutorul unui vector viral gena hTERT, care va furniza celulei suplimentul de telomeraza, care o îi va permite imortalizarea (etapa 4).
. Celula se va dezvolta acum dând naştere la o tumoare (etapa 5).
lată, deci, cum cancerul ia naştere la nivelul (onco)genelor. Pentru a-l îndigui, trebuie să intervenim fie la nivelul lor, fie la nivelul produşilor acestora, a (onco)proteinelor.
Nu vreau să abordez în mod formal şi sistematic domeniul terapiilor viitorului, pentru că este un capitol în care lucrurile evoluează de la o zi la alta. Voi descrie, în schimb, câteva dintre trăirile mele ştiinţifice, prin intermediul experienţelor pe care le-am efectuat, parcurgând o serie de domenii de vârf ale cercetării oncologice. Voi comenta, pe parcursul acestor descrieri şi în legătură cu ele, aspecte care m-au frapat din literatura ştiinţifică actuală. Cititorul va câştiga astfel, în mod indirect, o imagine a ceea ce se pregăteşte pentru anii ce vin.
Celule normale şi celule tumorale în cultură
