Cei care au deschis intamplator sectiunea la aceasta ina vor fi surprinsi ca, intr-o discutie despre cancer, sa se vorbeasca despre SIDA. Am indicat mai sus motivul acestei aparente digresiuni.
Virusul imunodeficientei umane (HTV-l), agentul cauzal al Sidei, se replica inserandu-si propriul material genetic intr-unui din cromozomii celulei umane infectate. Aceasta insertie este realizata de catre o enzima rala, integraza (. 9.1).
Cuprins:
Date generale |
sus  |
. interacţiunea enzimei cu fiecare dintre extremităţile ADN-ului viral (denumite LTR, Jong terminal repeca") şi excizia celor două nucleotide GT, situate la extremitatea 3\' a fiecărui lanţ, pentru a-i crea un hidroxil activ. Această etapă, denumită activare, sau maturare, se produce în citoplasmă, imediat după revers-trans-crierea genomului viral, din ARN în ADN.
. Deplasarea complexului de pre-integrare în nucleu şi "transferul" (integrarea) ADN-ului viral în ADN-ul celular.
Noi ne-am pus întrebarea dacă există în integraza vreun motiv molecular capabil de a recunoaşte în mod specific ADN-ul viral, în acelaşi fel în care un factor nuclear, de pildă, ar recunoaşte promotorul unei (onco)gene. în caz afirmativ, ar fi posibil, oare, să concepem un medicament care să ţintească tocmai acest motiv ?
Arhitectura domeniului catalitic al integrazei este cunoscută şi e prezentată în Fig. 9.2 (stânga), unde structurile a-helicoidale (în număr de 6) sunt indicate schematizat prin cilindri, iar cealaltă formă de structură secundară, foaia plisată p, este schematizată prin benzi late prevăzute cu săgeţi.
Enzima funcţionează sub formă (cel puţin) dimerică (să ne amintim şi ceea ce am spus mai în urmă în legătură cu enzima alanin dezhidrogenază). Suprafaţa de dimerizare (Fig. 9.2, dreapta) implică recunoaşterea reciprocă a a-helixurilor al şi a5 ale unei sub-unităţi, de către helixurile a5\' şi respectiv al\' ale celeilalte.
Noi am identificat în integrază un motiv "helix-tur-helix" (HTH, ,Jtelbc-furn-heIix"), constituit din helixurile a4 şi a5 şi bucla care le uneşte (Fig. 9.2, stânga). Cele două a-helixuri se încrucişează şi interacţionează între ele prin intermediul câtorva aminoacizi hidrofobi. Acest motiv este asemănător celui prezent în mai toate proteinele care interacţionează cu ADN-ul, fie că este vorba de bacteriofagii X, de procariote (proteinele "CMP"), sau de eucariote. Mai mult decât atât, motivul HTH e prezent şi în topoizomerazeie ! şi II ale eucariotelor (eucariote: organismele superioare, inclusiv omul, ale căror celule conţin un nucleu), dar şi în enzima gyrază, care este echivalentul topoizomerazei la bacterii (la procariote). Compararea structurilor cristaline (cunoscute) ale gyrazei şi topoizomerazei II arată, însă, că la aceste enzime motivul HTH nu intervine în interacţiunea cu ADN-ul. ci în dimerizarea sub-unităţilor de enzimă.
Noi ne-am propus să studiem motivul HTH al integrazei spre a-i defini rolul. Vom vedea că e! intervine atât în recunoaşterea specifică a ADN-ului viral, cât şi în oligomerizarea, de ordin superior dimerului, a sub-unităţilor de enzimă. Descrierea ce urmează are rolul de a prezenta cititorului un număr de tehnici fizico-chimice care permit abordarea nivelului cel mai detaliat al interacţiunilor la care participă moleculele de interes biologic.
în Fig. 9.3 e ilustrat unul dintre testele de activitate "in vitro" ale integrazei. Este vorba de testul de "autointegrare":
. Substratul ("materia primă\'\') a reacţiei îl constituie un fragment dublu-elicoidal de ADN, de 21 perechi de nucleotide, corespunzătoare extremităţii LTR a ADN-ului viral. In speţă, lanţul superior al dublului-helix din Fig. 9.3 (stânga, sus) conţine secvenţa CAGT, care va fi scurtată de către enzimă în urma clivării dinucleotidei GT în etapa de activare. Acest lanţ a fost în prealabil marcat la extremitatea opusă prin ataşarea (cu ajutorul enzimei polinucleotid-kinază) a unui fosfat radioactiv (reprezentat în diagramă printr-un punct întunecat).
. Dacă acest substrat migrează într-un gel de electroforeză de-naturant, dubiul helix se desface şi singurul element vizibil prin autoradiografle va fi o bandă corespunzând unui lanţ de 21 nucleotide (vezi coloana din stânga a electroforeogramei în Fig. 9.3, dreapta).
. Când enzima este prezentă, ea va genera, în etapa de activare, un oligonucleotid (marcat!) de 19 baze, care va migra mai rapid decât cel intact, de 21 baze (vezi culoarul din dreapta, jos).
. Ulterior, aceeaşi enzima va integra duplexul activat în "alt" ADN. Singurul ADN disponibil fiind duplexul-substrat, enzima va "autointegra" duplexul activat într-unui având aceeaşi secvenţă, pe care îl va considera drept "ADN celular". Produşii de autointegrare se văd în gel în partea de sus a culoarului.
Testul de autointegrare permite, aşadar, cuantificarea într-o singură experienţă a celor două etape enzimatice ale integrazei.
In prezenţa unui inhibitor, una, sau ambele etape vor fi inhibate. Concentraţia de inhibitor care face ca intensitatea benzii de 19 nucleotide (pentru reacţia de activare), sau a uneia din benzile superioare (pentru reacţia de autointegrare) să se reducă la jumătate faţă de intensitatea corespunzătoare culoarului conţinând enzimă fără inhibitor este reprezentată prin simbolul IC50. Este doza de inhibitor care reduce eficacitatea enzimei la jumătate. Cu cât valoarea IC50 este mai mică, cu atât inhibitorul este mai bun, mai puternic.
Pentru început, am sintetizat peptidele care, fiecare, reprezintă porţiuni ale motivului HTH şi le-am studiat separat. în Fig. 9.4 e prezentat primul dintre acestea, peptidul K159, care conţine secvenţa helixului a4, a buclei şi începutul helixului a5. El se poate vedea atât sub formă de model molecular schematizat (dreapta), cât şi în "proiecţie" axială, pentru a sublinia faptul că reziduurile hidrofobe din poziţiile "a" şi "d" ale secvenţei polipeptidice se regrupează toate de aceeaşi parte a a-helixului. Acidul aminat de la extremitatea C-terminală a peptidului este o tirozină care a fost reprezentată deosebit de celelalte, prin sfere van der Waals.
Această tirozină nu face parte din secvenţa propriu-zisă a enzimei. Ea a fost inclusă pentru a permite măsurarea concentraţiei peptidului (prin înregistrarea benzii de absorbţie a tirozinei în preajma lungimii de undă de 275 nm) şi pentru a urmări, prin variaţia randamentului cuantic al fluorescentei acesteia, modificările structurale suferite de întreaga moleculă.
O primă surpriză (obţinută pe baza combinării unor măsurători de fluorescentă) a fost constatarea că, la concentraţii moderate (şi, indus fiind de prezenţa în mediul apos a unui solvent, trifluoretanolul, care are darul de a "simula" mediul intern al unei proteine), peptidul K159 se curbează de la sine, "ştiind" cum să adopte aceeaşi structură (helix-tur-helix) ca cea pe care o are în interiorul enzimei. Conformaţia lanţului polipeptidic este deci "predestinată" de către structura sa primară, chiar şi atunci când molecula este scurtă şi lipsită de anturajul aminoacizilor ai restului proteinei.
O a doua constatare (obţinută prin măsurători de rezonanţă magnetică nucleară, RMN) a fost că, la concentraţii mai ridicate, două a-helixuri peptidice vin în interacţiune prin "coastele" lor hidrofobe, "a" şi "d", menţionate mai sus şi se supra-înfaşoară, unul în jurul celuilalt, ca să formeze o ,forsad3" de helixuri.
Faptul că două helixuri identice (şi afine unul pentru celălalt) se torsadează spontan poate fi demonstrat cu multă uşurinţă: pliaţi în două firul spiralat al receptorului telefonic. Veţi constata că cele două spirale se răsucesc automat una în jurul celeilalte!
Noi credem că doi dimeri de enzimă, ca cei din Fig. 9.2, realizaţi prin contacte de tipul al :a5\' şi a5:al\', dimerizează în continuare, pentru a crea un tetramer. prin formarea unei torsade la nivelul helixurilor a4 a doi dimeri vecini. Credem că un asemenea proces ar fi necesar, de pildă, atunci când cele două extremităţi ale ADN-ului viral (ancorate la dimerii de integrază) se apropie unele de altele în faza premergătoare înserării lor în ADN-ul celular.
Ei bine, pornind de la peptidul K.159, noi am dezvoltat două tipuri de inhibitori ai integrazei:
- peptide capabile să formeze o torsadă cu helixul a4 al enzimei, împiedicându-i oligomerizarea funcţională.
- anticorpi anti-Kl 59, care recunosc helixul a4 al enzimei şi o inactivează pe cale imunitarâ.
Prin încercări repetate, cu peptide din ce în ce mai scurte, am reuşit să localizăm epitopul (porţiunea de peptid) recunoscută de anticorpi. Ea este situată tocmai în zona de buclă.
Poate că nu printr-o simplă coincidenţă, zona de buclă conţine şi un "semnal de localizare nucleară" (NLS, ,/mclear localizaiion s/gwa/"). Prezenţa unei asemenea secvenţe de aminoacizi într-o proteină îi "spune" acesteia că trebuie să se dirijeze spre nucleu. Porii nucleari conţin receptori care o recunosc şi îi facilitează accesul. E normal ca integrază să se dirijeze spre nucleu odată ce a "recuperat" şi activat ADN-ul viral din citoplasmă!
Un produs chimic care s-a dovedit a fi un puternic inhibitor al integrazei se fixează şi el în zona helixului a4 al enzimei. Toate acestea au darul să sublinieze faptul ca motivul HTH al integrazei este esenţial funcţionării acesteia.
Ne-am pus apoi problema interacţiunii aceluiaşi peptid cu ADN-ul. Am vrut să cunoaştem importanţa stabilităţii helixului a4 în recunoaşterea secvenţei LTR virale, rolul grupărilor laterale ale ct-helixului în acest proces de recunoaştere şi "harta" interacţiunilor acizilor aminaţi ai peptidului cu nucleotidele aparţinând secvenţei de ADN. Pentru aceasta am sintetizat o serie de peptide de secvenţe uşor diferite, care să adopte o structură elicoidală în soluţie apoasă, de data aceasta, fără adaos de trifluoretanol. In Fig. 9.5 e ilustrată proiecţia axială a unei astfel de secvenţe, denumită K156 (SQAKLEEMNKELKKLLAQVRAQY), cu scopul de a ilustra felul în care structurarea unui peptid poate fi modulată prin introducerea în secvenţă a unor reziduuri cu proprietăţi specifice. Secvenţa K156 este analogă celei a helixului a4 (SQGVVESMNKELKKJIGQVRY), doar că a suferit următoarele "îmbunătăţiri":
. în K156, faţa polară, despre care se presupune ca ar interacţiona cu ADN-ul, este "conservată", iar ţaţa apolară. importantă în procesul de formare a torsadei de helixuri, este "ameliorată" prin utilizarea de aminoacizi apolari mai puţin voluminoşi.
. Sunt trei perechi de reziduuri K (bazic) şi E (acid), vecine pe aceeaşi verticală, care pot acum interacţiona favorabil prin atracţie electrostatică, ceea ce conduce la stabilizarea structurii elicoidale. Structura peptidelor astfel concepute a fost confirmată prin RMN
(la concentraţii ridicate) şi prin dicroism circular (la concentraţii diluate), iar "cartografierea" interacţiunii cu LTR-ul a fost realizată prin tehnica de anizotropie a fluorescentei unei molecule de ADN marcate cu fluoresceină. De exemplu (Fig. 9.6), indexul de deplasare chimică (CSI, ,fihemicalshifi index") al protonilor carbonului a ai fiecărui aminoacid din secvenţa lui K156 (care reprezintă diferenţa dintre valoarea măsurată prin RMN şi valoarea observată într-o structură presupusă dezordonată) are pretutindeni valori negative, ceea ce dovedeşte că este structurat în a-helix pe toată lungimea peptidului. Structurarea este mai puternică la pH neutru pentru că, aşa cum era de aşteptat, este facilitată de atracţia electrostatică dintre reziduurile încărcate respectiv negativ şi pozitiv.
Pentru analiza structurării peptidelor în soluţii dispunem de "semnături" de dicroism circular ale lanţurilor polipeptidice (Fig. 9.7), tot
aşa cum există semnături şi pentru polinucleotide (am fost nevoiţi chiar noi să perfecţionăm sistemul acestor "amprente" - vezi mai sus). Se pot identifica şi cuantifica astfel conformaţiile de tip elice a, foaie plisată 3, ,j3-tum" (un fel de zig-zag), sau structură dezordonată (.random").
De dragul istoriei, deschid aici o paranteză pentru a atenţiona asupra faptului că, în domeniul benzilor negative de la 195-203 nm, îşi mai au amprenta şi structurile "colagenoase" ("collagen-Iilce1\'\'), realizate prin înfăşurări multiple de lanţuri peptidice cu conţinut de aminoacizi speciali.
Noi am "re-descoperit" acest lucru (cunoscut de mult, de altfel!) după o considerabilă bătaie de cap. lată în ce context. Am fost solicitaţi de o echipă de la un alt institut parizian, care se ilustrase prin descifrarea mecanismului de recunoaştere a limfocitelor T4 de către virusul HIV-1, să descriem la nivel molecular interacţiunea dintre un fragment sintetic de nucleolină şi o moleculă care s-a dovedit a fi un puternic inhibitor viral. Nucleolină este o proteină care face un "du-te vino" între membrana celulară şi nucleu, deşi rolul ei exact nu e încă precizat Am fost încurcaţi de forma spectrului de dicroism circular al fragmentului de nucleolină şi doar într-un târziu ne-am data seama că era "collagen-like" şi că inhibitorul i se ataşa cu putere.
Părerea noastră este că virusul HTV-l însuşi se ataşează la molecula de nucleolină, care joacă rolul unui receptor membranar, care ar putea internai iza virusul fără aportul presupus al receptorilor CD4.
Inhibitorul de care vorbim, blocând nucleolină, ar împiedica, deci, intrarea virusului în celulă. Această explicaţie, care, pentru moment, merge împotriva curentului, ar explica de ce virusul poate infecta uneori şi alte tipuri de celule, nu numai limfocite purtătoare de receptori CD4!
Să revenim, însă, la eventualii inhibitori peptidici ai integrazei virusului HIV-1, care emană din braţul a4 al motivului HTH al enzimei.
Anizotropia de fluorescentă, A (Fig. 9.8, stânga) măsoară mobilitatea unui fluorofor (în cazul de faţă, mobilitatea fluoresceinei, ataşată chimic la extremitatea moleculei de ADN), care depinde de volumul hidrodinamic al complexului ADN-peptid. Curbele de titrare a unei concentraţii fixe de LTR cu concentraţii sporite de peptid (Fig. 9.8, dreapta) pot fi analizate numeric pentru a furniza constantele de disociere a complecşilor.
In cazul ilustrat, există două moduri de fixare a peptidului la LTR: un mod de interacţiune puternică, despre care am arătat în continuare că este specifică pentru secvenţa situată la extremitatea de LTR care urmează să Fie "activată" şi un mod de interacţiune slabă, de care poate da dovadă oricare partener de tip ADN - peptid.
Interacţiunea "puternică" este realmente puternică! O valoarea de Kj de ordinul nanomolar n-o întâlnim decât rareori, la anticorpi, de pildă. Aceasta subliniază afinitatea deosebită pe care o are integraza pentru substratul său şi confirmă implicarea "braţului" a4 al motivului HTH al integrazei (şi) în recunoaşterea ADN-ului viral.
De ce dorim să deţinem informaţii atât de precise despre partenerii la interacţiuni? Acest lucru va deveni mai limpede după ce vom descrie şi comportamentul celuilalt "braţ" al motivului HTH, helixul a5.
Noi am sintetizat doi analogi peptidici ai helixurilor al si a5 ale corpului catalitic al integrazei. pe care i-atn numit INHI şi 1NH5. Că fiecare dintre ei "recunoaşte" peptidui antisimetric dar nu pe sine însuşi e demonstrat prin fluorescenta unui derivat antracenic al lui INH5, menţinut constant, la concentraţie mică, în timp ce este titrat cu ceilalţi parteneri nefluorescenţi (Fig. 9.9, stânga): Dimerizarea lui rNHI cu INH5 se realizează la concentraţii modeste ale celor doi parteneri (concentraţia la care efectul atinge 50%, Cos este de 11 uM), în timp ce «w/oasocierea lui rNH5 se realizează doar la concentraţii ridicate (C05 este de 266 uM). Această experienţă confirmă între altele, faptul că, la suprafaţa de dimerizare, contactele dintre subunităţile de enzimă se realizează în mod "antiparalel"(al :a5\' şi a5:al\').
Prin cromatografie de excluziune sterică (Fig. 9.10) am demonstrat că interacţiunea lui INH5 sau INHI cu integraza (IN) conduce la disocierea acesteia, mai întâi în dimeri şi monomeri, apoi numai în monomeri. Mai mult decât atât, am arătat că monomerii astfel generaţi se "denaturează" imediat, enzima neputând exista, pare-se, decât sub formă de oligomer.
Aceste peptide acţionează deci ca inhibitori ai enzimei pentru că o disociază în monomeri inactivi. INHl e mai puţin eficient în schimb, constanta de inhibiţie (IC») realizată de INH5 în testul de autointegrare este de ordinul nanomolar. Este una dintre cele mai "puternice" constante de inhibiţie obţinută vreodată cu un peptid.
Ultima mea surpriză a fost să descopăr că integraza, care se lasă greu studiată, pentru că este foarte instabilă în soluţie, precipită în urma unei schimbări de conformaţie de ansamblu, de la elice a la foaie piisată 0. Dacă privim structura corpului catalitic al enzimei (Fig. 9.2, stânga), ne putem imagina că helixurile a4 şi a5 s-ar derula, urmând ca lanţurile polipeptidice constituente să se "ataşeze" prin alipire la foaia piisată p, care constituie inima moleculei. Foile plisate au "darul" de a se etaja unele peste altele, conducând la precipitare prin formarea unor agregate majore, denumite "fibre amieloide".
Dar tocmai aşa se comportă şi primul, răspunzător de maladia spongiformă bovină ("vaca nebună"), precum şi proteinele de membrană în boala lui Alzheimer şi în unele boli neurodegenerative!
Asemănarea dintre structura prionului (Fig. 9.11) şi cea, acum familiară, a corpului catalitic al integrazei este destul de evidentă. în colţul din stânga jos e reprezentată structura prionului precipitat
lată-mă, din nou, în inima unui domeniu ,.cald". promiţător, căci dacă vom reuşi să controlăm unul dintre procese, le vom putea controla pe toate celelalte!
Recent am reabordat şi topoizomeraza II, confirmând ceea ce am spus în legătură cu aplicabilitatea generală a unor principii stabilite în circumstanţe aparent distante. Am revenit, aşadar. Ia cancer. Deschiderea "porţii" de jos a dimerului topoizomerazei II în vederea trecerii primului lanţ de ADN (re-vezi Fig. 4.7) este o schimbare de conformaţie în care sunt implicate, tară îndoială, cele două a-helixuri indicate în Fig. 9.12 prin săgeţi, care acţionează drept pârghii. Conducându-ne după principiul "torsadei" de helixuri. noi am sintetizat analogi peptidici ai helixurilor respective. Aşa cum am prevăzut, fiecare dintre peptide în parte a ..recunoscuf\' structura echivalentă din enzimă şi a .,înfăşurat-o" prin torsadare. Enzima, al cărei sistem de pârghii a fost astfel rigidizat, a încetat să funcţioneze. Iată, deci, că o nouă generaţie de agenţi terapeutici anticanceroşi bate la poartă!
Ce ne propunem să facem în continuare?
Demersul pe care îl descriu este într-un stadiu mai avansat în ceea ce priveşte inhibitorul INH5, dar principiul este general şi va fi aplicat, probabil şi la celelalte peptide.
. Vom ameliora helicitatea peptidului modificându-i secvenţa de aminoacizi, pentru a-i mări potenţialul de interacţiune cu helixul-ţintă. Considerentul este de natură termodinamică: dacă această interacţiune solicită o structură elicoidală din partea peptidului, înseamnă că, impunându-i această structură "dinainte", el va cheltui mai puţină energie liberă în momentul interacţiunii cu ţinta pentru a se adapta la structura acesteia.
. Vom funcţionaliza peptidul cu o "secvenţă-semnal", care să-l antreneze dincolo de membrana celulară, în citoplasmă. Nucleolina, despre care am pomenit, ar furniza, poate o astfel de funcţie, dar sunt cunoscute şi alte secvenţe-semnal, mai bine documentate. Cu o rezervă, totuşi, servind de atenţionare: primul test, în care secvenţa-semnal provenea din proteina Tat a virusului HIV-î, a eşuat lamentabil. In loc să conducă inhibitorul la integrază. secvenţa Tat şi-a făcut singură de cap, fixându-se pe secvenţa TAR a ARN-ului mesager al virusului, stimulându-i transcrierea!
Am făcut mai mult rău decât bine. Dar a fost doar primul eseu. (Culmea, deşi rezultatul era previzibil, nimeni dintre utilizatorii anteriori ai acestei secvenţe nu au raportat o stimulare a proliferării virale! Se pare că nu se raportează decât experienţele reuşite!)
. Vom căuta să creăm peptidomimetice ale acestor inhibitori. Peptidomimeticul este o moleculă de cu totul altă natură chimică decât peptidul, dar ale cărui grupări chimice importante pentru realizarea de interacţiuni sunt dispuse la fel ca şi în peptidul original. Iată de ce e importantă "cartografierea" tuturor interacţiunilor inhibitorului la locul
de acţiune!
. Pe de altă parte, vom defini un farmacofor al ţintei fiecărui inhibitor. Farmacoforul este o entitate, aş zice, informaţională. El reprezintă descrierea naturii şi poziţionării fiecărei grupe active din zona "ţintei" (a peptidelor a5, sau a4 ale enzimei, de pildă).
După definirea unui farmacofor într-o zonă importantă pentru funcţionarea unei enzime - de exemplu, farmacoforul echivalent pentru helixul a5, implicat în dimerizarea enzimei; sau pentru helixul a4, implicat în oligomerizarea enzimei dar şi în recunoaşterea specifică a secvenţei LTR; sau pentru motivul HTH în ansamblu), se caută în banca de date a tuturor produşilor naturali şi sintetici acea moleculă care va manifesta afinitate pentru ţinta respectivă. Molecula respectivă va deveni viitorul inhibitor. . In fine, în subsidiar, vom studia conversia conformaţională a -pa integrazei, privind cu coada ochiului la celelalte aplicaţii posibile în domeniile aparent ... ne-înrudite (!) ale prionului, ale maladiei lui Alzheimer, ale bolilor neurodegenerative.
Voiajul meu prin lumea cancerului se opreşte, deocamdată aici.
Date generale
