Anul 1991 a marcat in occident inceputul unei tendinte de scadere a mortalitatii prin cancer, tendinta care continua sa se mentina si astazi. Pe de alta parte, asistam la o crestere importanta a proportiei bolnavilor de cancer care depasesc o perioada de supravietuire de cinci ani. Dincolo de aceasta limita, se poate spune ca au invatat sa "traiasca cu boala" si ca vor ramane in viata. intr-adevar, in Statele Unite sunt opt milioane de persoane diagnosticate de cancer cu ani in urma si care continua sa traiasca si in ziua de azi.
Aceste schimbari in bine se datoreaza abordarii problemei cancerului pe trei directii complementare: a prenirii, a detectiei si a calitatii tratamentului. Abordarea fiecareia dintre directii n-ar fi fost posibila fara intelegerea mecanismelor moleculare fundamentale care stau la baza aparitiei cancerului.
Cuprins:
Gene, proteine, ciclu celular |
sus  |
Cancerul este o boală "genică"
Titlul de mai sus nu trebuie înţeles în sensul că boala canceroasă ar fi o maladie ereditară, ci că ea este datorată unor anomalii Ia nivelul genomului celular.
Cancerul se dezvoltă în mai multe etape şi începe cu transformarea oncogenică a unei singure celule. Celulele normale posedă un număr de mecanisme de control a multiplicării, care să o împiedice să se dezvolte în mod aberant In celula neoplazică, aceste mecanisme au fost scoase din ftincfiune.
Multiplicarea ei necontrolată este favorizată de câştigarea abilităţii de a se sustrage sistemului imunitar, care ar trebui. în mod normal, s-o elimine. Aceasta este datorită. în parte, faptului că celulele canceroase au pierdut multe dintre elementele de diferenţiere şi se "aseamănă" cu celulele embrionare, la o epocă când acestea aveau "dreptul" să se dividă.
Tumorigenicitatea se agravează apoi pe măsură ce importanţa stimulării paracrine (în care celulele vecine "sunt amăgite" să secreteze factorii de creştere necesari dezvoltării celulelor canceroase) diminuează în favoarea stimulării autocrine (în care celula tumorală a "învăţat" să secreteze ea însăşi factorii de creştere de care are nevoie, care se întorc în buclă la celula care i-a produs) şi apoi a celei intracrine (când stimularea creşterii se face prin factori endogeni, intracelulari, care, după cum vom vedea mai încolo, provin fie de la gene mutante, de exemplu/»5i, Ras, sau de Ia gene amplificate, de exemplu, Myc).
Creşterea unei tumori in situ este favorizată apoi de dezvoltarea de vase de sânge care să o irige, căci tumoarea ştie "chema" celulele endoteliale vasculare care vor construi capilare sanghine.
în fine, tumoarea capătă un potenţial de metastazare, pentru că celulele au posibilitatea să traverseze lamina bazală, acel strat de colagen care separă straturile de ţesut, datorită colagenazelor (enzime hidrolitice) pe care le secretează. Celulele rumorii primare se răspândesc apoi în tot corpul, creând tumori secundare. Fig. 4.1 prezintă imaginea unei astfel de tumori, efectuată în microscopie electronică de baleiaj, localizată în plămân: se observă celulele tumorale, de formă globulară, pe fundalul celulelor ţesutului-gazdă, etalate şi parcă transparente.
Realizarea remarcabilă a ultimelor decenii este înţelegerea faptului că fiecare dintre aceste etape ale cancerogenezei, de la prima celulă neoplazică, până la celula metastazată, se datorează câte unei modificări genetice adiţionale. Cu alte cuvinte, cancerul este o boală a genomului! Mai precis spus. este o boală în care genomul suferă alterări succesive.
Enumerarea datelor din capitolele precedente trebuie să ne fi condus la intuirea faptului că toţi factorii ambianţi - substanţele cancerigene, radiaţia, viruşii precum şi moştenirea ereditară - contribuie, prin acelaşi gen de mecanism, la dezvoltarea cancerului, afectând genele celulei normale. într-adevăr, substanţele cancerigene şi radiaţia produc modificări chimice ale genelor, viruşii îşi includ propriile gene printre cele ale celulei gazda iar ereditatea intervine prin aceea că transmite urmaşilor gene care conferă susceptibilitate la cancer.
Ce sunt genele?
Genele conţin patrimoniul de instrucţiuni transmise celulelor din generaţie în generaţie, care permit acestora să fabrice, pentru fiecare genă, un anumit tip de moleculă, în general de proteină.
Genele sunt localizate pe cromozomi, care la rândul lor se află adăpostiţi în nucleul celulei. Cromozomii sunt constituiţi din molecule de acid dezoxiribonucleic (ADN, sau DNA - ,^deoxyribonucleic acid"). Fiecare genă reprezintă un fragment de acid nucleic, o porţiune din acesta. ADN-uI este un polimer "linear", compus din două lanţuri ,polinucleotidice" înfăşurate unul în jurul celuilalt, formând un ,Mublu-helix" (se mai spune "o dublă-elice" - vezi Fig. 4.2).
Fiecare lanţ polinucleotidic este alcătuit din milioane de unităţi asemănătoare, denumite nucleotide. Un nucleotid este alcătuit la rândul său din următoarele elemente (Fig. 4.3):
. un zaharid (în cazul ADN-utui. acesta se numeşte ,/Jezoxiriboză"; în cazul ARN-ului, vezi mai jos, acesta se numeşte ,jiboză\' şi diferă de primul prin înlocuirea unui hidrogen, H, cu un hidroxil, OH);
- un Jos/at", rest de acid fosforic, care dă caracterul acid şi denumirea moleculei;
- o Jbază azotată\', una dintre cele 4 posibile: adenina, timina, guanina şi citozina.
Zaharidul şi fosfatul se înşimie alternând parcă în lungul unei panglici pe care sunt ataşate, din loc în loc, bazele. Sunt doar patru tipuri de baze diferite: adenina, timina, guanina şi citozina - prescurtate A,T,G,C -însă ceea ce contează este ordinea în care ele sunt aranjate în lanţ. Secvenţa unuia dintre cele două lanţuri ale dublului helix este complementară\' secvenţei lanţului opus în sensul că întotdeauna adenina (A) este în faţa unei timine (T), iar guanina (G) în faţa unei citozine .
Mesajul genetic adn şi arn |
sus |
Ordinea bazelor în oricare dintre cele două lanţuri ale dublului helix reprezintă .jnesqjul genetic" al genei, informaţia genetică, tot aşa cum cu ajutorul literelor alfabetului s-ar putea scrie cuvinte şi fraze şi transmite o informaţie sub formă de text.
Acidul ribonucleic (ARN, sau RNA, ,/ibonucleic acid\') se prezintă sub forma unui singur lanţ polinucleotidic în care zaharidul este
riboza, iar uraciful înlocuieşte timina (vezi Fig. 4.3). Vom vedea mai jos în ce circumstanţe el realizează un dublu helix cu unul din lanţurile de ADN. Acest ,Jieteroduplex" e bazat pe reguli de complementaritate similare celor ale bazelor azotate din ADN: G recunoaşte C, iar A recunoaşte, de data aceasta, V.
imaginea din Fig. 4.1, stânga, prezintă un model molecular al unei porţiuni de dublu-helix de ADN în care fiecare atom este reprezentat printr-o sferă. Sunt sferele van der Waals" ale atomilor respectivi, având raze de ordinul angstromilor (IA = 10~|Om).
Dimensiunile atomilor
Orice particulă atomică tinde să se apropie de vecinii ei până la o
distanţă reprezentată de sfera sa van der Waals. Această tendinţă universală dă moleculelor, macromoleculeior şi ansamblurilor (rnacro)moleculare forma lor compactă.
O structură macromoleculară compactă se realizează
în două moduri: fie că ea va fi globulară (acesta fiind cazul majorităţii proteinelor), fie că ea va fi elicoidală (acesta este cazul acizilor nucleici, ilustrat prin imaginea din Fig. 4.2). Chiar şi lipidele, care sunt molecule mici, se asociază între ele în mod ordonat, pentru a maximiza contactul reciproc şi a minimiza expunerea la mediul apos, alcătuind straturi bi- (sau
uni-) moleculare: membranele.
Anticipând ceea ce vom discuta mai încolo, în Fig. 4.4 e reprezentată o secţiune printr-o porţiune de celulă, lăsând să se vadă, în proporţie cu dimensiunile lor reale:
. membrana celulară (periplasmatică) în care sunt incluse proteine cu rol de transportor o proteină-canal ionic, care permite transportul selectiv doar al anumitor molecule; o proteină-receptor membranar, care fixează un iigand-semnal pe faţa externă a celulei şi transmite apoi "mesajul" către interiorul celulei;
. hemoglobina, care aduce şi eliberează oxigenul în preajma celulei, iar acesta difuzează apoi liber până la mitocondrie, unde este consumat de către "lanţul respirator";
. un anticorp, care poate că a fost secretat de către altă celulă, pentru ca să recunoască una dintre proteinele situate la suprafaţa celei din imagine şi să o blocheze.
Să ne apropiem de nivelul molecular
E important să intuim nivelul de detaliu la care vom aborda cancerul în acest capitol şi în următoarele. Pentru a putea conştientiza scala microscopică ia care ne vom referi, am înşiruit în Fig. 4.5 o secvenţă de imagini, reprezentând "măriri succesive" ale unui cromozom.
Ne imaginăm că pătrundem într-una dintre celulele (canceroase) în curs de diviziune din Fig. 4.1 şi continuăm a privi, mai întâi, Ia microscop, începem în momentul diviziunii celulei şi surprindem cromozomii în metqfază (a). Continuăm cu imaginea a două cromatide surori (doi cromozomi identici, împerecheaţi la nivelul centromerului - b). Restul se vede, eventual, cu microscopul electronic, iar apoi doar prin difracţie cu raze X: cromatina (supraînfăşurarea ADN-ului unuia dintre cromozomi -c, d), nucleosomii (complexe ale ADN-ului cu nucleoproteine, denumite histone - e, f) şi dublul helix, descris la nivel atomic (g, h).
Imaginile de mai jos şi încă câteva diagrame au fost adaptate după lucrarea "Mo/ecw/ar CellBiologf de R.G. van Buskirk şi V.K. Liyanage.
Fluxul informaţiei genetice |
sus |
Replicarea ADN-ului se bazează pe complementaritatea lanţurilor sale (Fig. 4.6, stânga): dublul helix se deschide, creând o furcă de replicare, urmând ca după modelul fiecăruia dintre lanţurile devenite astfel accesibile să se sintetizeze unul complementar. Fără a intra în alte detalii, reţinem că dintr-un dublu helix se realizează, în mod "semiconservativ", două dublu-helixuri identice, fiecare dintre ele având un lanţ parental şi unul nou sintetizat.
Exprimarea informaţiei fiecărei gene are drept scop sinteza unei proteine. Ea începe prin sinteza unui lanţ de ARN mesager (ARNm, sau mRNA), a cărui secvenţă copiază secvenţa de baze a genei (Fig. 4.6, centru). Este etapa de ,jranscriere\'\'\'.
Proteina codificată de genă este sintetizată apoi prin "lectura" secvenţei de mRNA, în care fiecare grup de trei baze azotate codifică un aminoacid. Acest proces se numeşte ,Jraducere" (Fig. 4.6, dreapta).
Secven{a de aminoacizi a lanţului polipeptidic astfel sintetizat este "coliniară" cu secvenţa de baze din ADN şi constituie .structuraprimară^ a viitoarei proteine.
Cu titlu informativ, pentru că nu influenţează înţelegerea a ceea ce va urma, indicăm mai jos "codul genetic": pe latura din stânga se află înscrisă prima literă a tripletului de baze (a codonului) corespunzând unui aminoacid; în fruntea fiecărei coloane este a doua literă, iar pe latura dreaptă e marcată litera a treia Aminoacizii sunt indicaţi în prescurtarea cu trei litere şi, respectiv, cu o literă. Alături, sunt indicate denumirile complete (în engleză) ale acestora.
Nu e cazul să abordăm rolul proteinelor. Precizez, totuşi, că în afara rolurilor bine cunoscute - structural, enzimatic - un număr important de proteine sunt implicate în controlul fluxului de informaţie genetică şi a modulării comportamentului celulei în funcţiile de cerinţele mediului ambiant acesteia. Tocmai aceste din urmă funcţiuni sunt afectate în cancer.
Structurile primară, secundară, terţiară şi cuatemară a macromoleculelor
Lanţul polipeptidic nou sintetizat se structurează în spaţiu - vezi ilustrarea procesului în cazul unor "enzime onorifice", cum sunt mioglobina şi hemoglobina (Fig. 4.7). Hemoglobina are toate proprietăţile unei enzime, dar nu catalizează propriu-zis nici o reacţie: ea are rol de transportor "inteligent" de oxigen: îl recuperează în plămâni, acolo unde el este în exces şi îl degajă în ţesuturi, acolo unde el este necesar.
Formarea legăturii peptidice (,peptide bond\',) este echivalentă cu eliminarea unei molecule de apă între gruparea amino a primului aminoacid şi gruparea carboxil a celui de-al doilea (vezi prima imagine). Lanţul polipeptidic "creşte" în continuare în sensul de la "N-terminal" spre "C-tenninal" (a doua imagine). Pe baza unor interacţiuni de scurtă distanţă cu residuurile vecine, se realizează mai întâi structura secundară (a treia imagine).
In cazul hemoglobinei, structura secundară care predomină este cea de a-helix proteic (a nu se confunda cu dublul-helix de ADN!) Apoi, prin interacţiunile dintre regiuni mai îndepărtate ale proteinei deja structurate la un prim nivel, se realizează structura terţiară, în general globulară (în imaginea a patra vedem structura mioglobinei, o proteină similară hemoglobinei, dar care rămâne la stadiul de monomer). în fine, mai multe globule (subunităţi) proteice identice sau diferite se asociază între ele generând structura cuatemară (în cazul ilustrat, este vorba de tetramerul de hemoglobina, ultima imagine). Abia în acest stadiu proteina şi-a câştigat funcţionalitatea. Despre aceste etape vom mai discuta şi în Partea a IIl-a.
A fost necesar să ne reamintim aceste principii de bază referindu-ne ia o proteină arhicunoscută, pentru a putea aborda apoi şi alte molecule, mai puţin "frecventate", dar importante în cancer.
Rolul proteinelor în controlul topologiei adn-ului |
sus |
Topoizomeraza II
E momentul să facem cunoştinţă aici cu una dintre enzimele care intervin în procesul de replicare şi transcriere a ADN-ului: topoizomeraza i7(vezi Fig. 4.8). Ea are rolul de a "relaxa" ADN-ul "încâlcit" în momente precum cel al creării furcii de replicare, pentru a facilita accesul enzimelor care efectuează propriu-zis replicarea (şi, la alt moment, transcrierea). Rolul topoizomerazei 11 este esenţial: în lipsa ei, replicarea ADN-ului stagnează şi celula nu se mai multiplică.
Structura topoizomerazei II ste cunoscută astăzi la nivel molecular (Fig. 4.8). în stânga e prezentat atât modelul molecular simplificat (sub formă de panglică) al enzimei, cât şi cel realist, în care atomii sunt reprezentaţi prin sferele van der Waals respective. Enzima este activă sub formă de dimer (deci, structura sa cuatemară presupune două subunităţi identice). în dreapta este ilustrat mecanismul ei de funcţionare:
. Prima moleculă (un dublu-helix) de ADN se ataşează la enzimă în timp ce "poarta 1" este deschisă (vezi primele 2 etape ale ciclului, începând din stânga sus).
. Are loc o schimbare de conformaţie care permite ataşarea "în curmeziş" a celei de-a doua molecule de ADN.
. Poarta 1 se închide, prima moleculă de ADN este scindată în două, iar a doua moleculă de ADN trece de partea cealaltă a acesteia şi părăseşte enzima prin poarta 2, care acum este deschisă.
. Prima moleculă de ADN este sudată (ligandatâ), iar eliberarea sa este concomitentă cu reînchiderea porţii 2 şi deschiderea porţii I, astfel că ciclul poate continua.
Antraciciinele
Evident, topoizomeraza II este o enzimă-cheie în proliferarea celulelor canceroase şi blocarea ei prin agenţi terapeutici este o soluţie evidentă. Antraciciinele, acele medicamentele chimioterapice ale anilor \'70, zise "intercalante" în ADN, graţie cărora cancerul a regresat în lume cu câteva zeci de procente, acţionează tocmai prin blocarea topoizomerazei.
La data când s-au descoperit antraciciinele se credea că simpla blocare a enzimei pe ADN ar fi suficientă pentru a opri evoluţia cancerului. Ulterior a devenit limpede că nu este suficient să opreşti celulele canceroase din multiplicare (efect citostatic), ci trebuie să le distrugi (efect citotoxic). Norocul face că antraciciinele blochează ciclul topoizomerazei II la stadiul unde prima moleculă de ADN este scindată. Celulele posedă un mecanism prin care recunosc dacă ADN-ul lor este intact, iar în caz contrar ordonă autodistrugerea lor programată: apoploza. E ceea ce se întâmplă în cazul antraciclinelor ele surprind complexul ADN-topoi-zomeraza II în momentul replicării ADN-ului şi generează molecule de ADN fragmentat care vor impune celulei să se autodistrugă prin apoptoză.
Un mecanism similar asigură eficacitatea cis-platinului. în acest caz, rupturile produse în ADN printr-un mecanism bazat pe radicali liberi nu pot fi reparate pentru că anumite proteine nucleare, din categoria WMG\\(,Jligh mobility group"), implicate în mod normal în controlul structurării ADN-ului, se ataşează preferenţial pe moleculele deteriorate.
Antraciciinele. ca toate chimioterapicele, de altfel, au un inconvenient important: ele difuzează în toate celulele organismului, inclusiv cele sănătoase. Acolo nu numai că interferează cu ADN-ul lor (se zice că sunt lipsite de "specificitate"), dar cauzează şi alte efecte secundare majore datorită radicalilor liberi pe care îi generează. Asupra topoizomerazei II şi aantraciclinelor vom mai reveni în Partea a HI-a.
Controlul fluxului de informaţie genetică prin controlarea duratei de viaţă a moleculelor şi prin alte modificări chimice |
sus |
Fluxul informaţiei genetice se orientează, aşadar, de la genă spre proteină. Fiecare dintre gene se manifestă prin sinteza unei anumite proteine care ia apoi parte la funcţionarea celulei. Exprimarea genelor este strict controlată de către celulă la nivelul:
. ritmului de transcriere a ADN-ului (despre care vom discuta mai jos).
. ritmului traducerii, prin controlarea duratei vieţii ARN-ului mesager şi a eficienţei etapelor în care este implicat,
. duratei vieţii şi activităţii proteinelor.
Orice modificare a ritmului de expresie a vreunei gene (în final, orice modificare a concentraţiei celulare a unei anumite proteine), ca şi a integrităţii unei proteine duce la modificări funcţionale ale celulei, care pot conduce la modificări fiziologice majore.
Modularea selectivă a activităţii proteinelor
Nu mă opresc la aspectele privind prelucrarea (episarea, editarea) ARN-ului mesager şi nici privind modul de a influenţa durata sa de viaţa în celulă, ci trec direct la proteine.
Multe procese celulare cer modularea selectivă a activităţii unor proteine ca răspuns la anumite situaţii fiziologice. Două dintre felurile prin care se poate modula activitatea unor proteine sunt fosforilarea şi ubiquitinarea:
. Enzimele numite protein-kmaze ataşează grupe fosfat pe residuurile tirozină, treonină sau sermă ale proteinei vizate, care, suferind o schimbare de conformaţie, îşi reduce sau măreşte activitatea. Revenirea la starea iniţială este realizată prin îndepărtarea grupei fosfat de către o altă categorie de enzime, denumite protem-fosfataze.
. Ubiquitinarea unei proteine constă în ataşarea la aceasta a mai multor molecule de ubiquitină de către o ubiquitin-ligază, drept care proteina astfel "marcată" este recunoscută şi distrusă de către un complex proteazic numit proteazom. Controlul ciclului celular, de pildă, este realizată de o serie de proteine denumite cicline, a căror degradare e realizată prin ubiquitinizare. Pentru a permite acumularea de cicline în momentele premergătoare mitozei, ubiquitin-ligazele sunt inactivate.
Modificări post-traducţionale ale proteinelor
Proteinele care au extremitatea N-terminală liberă sunt degradate rapid. Majoritatea proteinelor sunt acetilate imediat după sinteză (Fig. 4.9, sus).
O altă transformare post-traducţională a proteinelor constă în ataşarea unui acid gras. Este cazul proteinei Ras (Ras, de la ,jat sarcoma", sarcom de şobolan), denumită şi p2I, despre care vom mai vorbi. Simbolul p21 înseamnă "proteina de masă moleculară 21 de kilodaltoni". Terminologia se menţine la multe proteine de la epoca când acestea au fost identificate prin electroforeză, dar nu li se cunoştea încă rolul. Acidul gras, ataşat la extremitatea C-terminală a proteinei Ras, se numeşte farnesyl şi dirijează proteina spre integrare în faţa internă a stratul dublu-lipidic membranar (Fig. 4.9, jos). Despre această proteină, adesea implicată în cancer, vom mai pomeni.
Multe proteine sunt glicozilate după sinteză, adică Ii se ataşează reziduuri de carbohidraţi. Dacă proteina nu are încă un nume, ea primeşte prefixul "gp" ("glicoproteină"). De exemplu, P-gp este proteina "rezistenţei multiple la medicamente" (MDR, ,/nulti-drug resistance,r): este vorba despre o proteină cu rol de "pompă", care elimină din celulă anumite clase de medicamente, inclusiv cele folosite în chimioterapie. Tratamentul chimioterapeutic este adesea compromis de faptul că una dintre celulele tumorale "achiziţionează" această genă pe parcurs, urmând ca "urmaşii" ei să continue să se dezvolte pe baza avantajului selectiv astfel dobândit.
Rolul proteinelor în controlul ciclului celular
Fazele ciclului celular
In clipa când celulele umane au primit permisiunea sâ se dividă, ciclul celular astfel inaugurat durează cam 24 de ore şi constă din cinci etape:
- în faza Go (G înseamnă ,growth", faza de "creştere"), celula nu proliferează şi poate rămâne astfel un timp nelimitat.
- In faza Gi, se sintetizează o serie de proteine esenţiale pentru etapele care vor urma. Există un moment de control (,,G|-checkpoinf) dincolo de care nu se trece dacă ADN-ul prezintă defecţiuni. Controlul e realizat de proteinap53, care "decide" dacă ADN-ul poate fi reparat, în care caz se aşteaptă repararea acestuia. In caz contrar, p53 decide moartea programată (apoptoza) celulei. O proteină p53 defectuoasă, care ar permite replicarea unui ADN impropriu, ar conduce la mutaţii şi cancer. De altfel, pe măsură ce tumoarea avansează "în vârstă", creşte şansa ca printre celulele tumorale să se selecţioneze şi unele cu preoteina p53 mutantă, ceea ce augmentează tumorigenicitatea neoplasmului.
- în faza S (de "sinteză") are loc sinteza (replicarea) ADN-ului. O serie de enzime verifică apoi şi corectează acurateţea împerecherii lanţurilor complementare prin citirea ("editarea" -,j)roofreadin^) a secvenţei în curs de elaborare, urmată de excizia şi înlocuirea bazelor sau a segmentelor de ADN defectuoase.
- In faza G2 celula creşte şi mai mult şi o nouă serie de proteine sunt elaborate. La punctul de verificare "G2" ("GTcheckpoinf) sunt eliminate acele celule care nu au terminat în bune condiţii replicarea ADN-ului.
- Cu etapa G2 ia sfârşit interfaza. Mitoza propriu-zisă (cytokineza şi karyokineza - separarea citoplasmei şi a nucleului) are loc în faza M. La "punctul de control M" {jM-checkpoint) se verifică dacă cromozomii sunt corect aliniaţi. Alte mecanisme împiedică ADN-ul să înceapă replicarea a doua oară. Dacă cromatidele surori nu se separă corect în momentul anafazei (ceea ce poate sâ se întâmple dacă anafaza începe înainte ca centromerii să se fi replicat), una dintre celulele-fîice riscă să aibă un cromozom în plus în dauna celeilalte. Aşa apare, de exemplu, trizomia-21.
Celulele intră sau ies din diversele faze ale ciclului celular sub efectul controlului exersat de o familie de prolein-kinaze. Experienţele de fuziune celulară confirmă faptul că e vorba de factori citoplasmatici solubili: într-adevăr, celula din Fig. 4.10 (dreapta) este un hibrid realizat între o celulă în faza G| şi o alta în faza M. Ca urmare a reunirii conţinutului citoplasmelor celor două celule, cromozomii primei celule au primit ordinul să se condenseze şi ei!
Sincronizarea evenimentelor ciclului celular se realizează "prin acumulări cantitative, care duc la salturi calitative", pe baza unui principiu analog clepsidrei. Iată un exemplu:
- Complexul macromolecular proteic care declanşează mitoza propriu-zisă se numeşte MPF (,Mi\'osis-promotingfactor") şi este un heterodimer alcătuit din ciclina B şi protein-kinaza Cdc2 (denumită şi Cdkl).
- Ciclina B este sintetizată pe tot parcursul interfazei şi, pe parcursul fazelor S şi G2, complexează protein-kinaza Cdc2, care începe prin a se autofosforila ea însăşi, în trei locuri precise, dintre care două au rol inhibitor şi unul activator al activităţii enzimei. Anumite fosfataze îndepărtează apoi cele două grupări fosfat cu
rol inhibitor, astfel că Cdc2 poate acum fosforila alte proteine implicate în mitoză.
- Concomitent cu declanşarea mitozei, ciclina B este ubiquitinatâ, astfel încât este preluată de proteazom şi degradată.
- în lipsa ciclinei B, odată cu dispariţia complexului MPF, cromozomii se decondensează, se reformează membrana celulară, iar subunitatea Cdc2 este defosforilată în aşteptarea intrării într-un nou ciclu, care începe prin sintetizarea de noi molecule de ciclină B.
Alte cicline controlează celelalte momente ale ciclului celular. în mod evident, dereglarea acestora e detrimentală celulelor şi poate conduce la proliferarea lor necontrolată. E limpede, de asemenea, că ciclinele constituie puncte nevralgice care ar putea fi vizate de medicamente destinate a combate cancerul.
Rolul proteinelor în derularea mitozei şi în menţinerea arhitecturii celulei
Menţinerea arhitecturii celulei şi dinamica acesteia este asigurată de trei categorii de ansambluri macromolecuiare de proteine. în ordinea taliei, ele sunt\'
. microtubulii,
. filamentele intermediare.
. microfilamentele de actină. Nu insist asupra rolului microfîlamentelor de actină, care dau
forma celulei şi par a o susţine pe dinăuntru precum o reţea ce suspine o pânză de cort (vezi Fig. 4.10, stânga). Menţionez în trecere că cytochcdasinele sunt medicamente care inhibă polimerizarea actinei, în timp ce phaloidinele (din ciupercile veninoase) inhibă depolimerizarea acestora Microfilamentele nu trebuie confundate cu elementele structurale mult mai mari, reprezentate de microtubuli.
Microtubulii sunt alcătuiţi din două tipuri de subunităţi de proteină, denumite .Jubuiine". Ei sunt cei care asigură, între altele, separarea nucleelor în timpul mitozei. Microtubulii fusului de diviziune sunt vizibili în celula hibridă, obţinută prin fuziune, din Fig. 4.10 (dreapta). Asamblarea ("polimerizarea") microtubulilor este destabilizată de agenţi precum nocodazolul. vinblastina sau colchicina, sau "îngheţată" de taxol, epithilon B sau discodermolid. Evident, microtubulii sunt o ţintă promiţătoare pentru viitoare medicamente destinate a combate proliferarea celulelor canceroase.
Rolul proteinelor în controlul transcrierii mesajului genetic |
sus |
Pentru ca celula să dispună de proteinele de care are nevoie la momentul adecvat şi în concentraţia optimă, ea exersează un control la mai multe nivele, dintre care cel transcripţional este preponderent. în acest fel, din noianul de gene (căci toate celulele organismului dispun de acelaşi genom) se exprimă la un moment dat cele care determină fenotipul celulei plus cele care sunt implicate momentan în răspunsul celulei la condiţii particulare de mediu.
La nivel de cromozom, unele gene sunt mai mult sau mai puţin accesibile, în funcţie de structurarea cromatinei (complexarea acesteia cu histone şi cu alte proteine de mobilitate electroforetică ridicată, cunoscute sub numele HMG - .Jiigh mobility group"), un proces în permanent dinamism.
La nivel individual, genele conţin, în afara secvenţelor codante (exonii) - şi, fără a mai zăbovi asupra intronilor (secvenţe non-codante care "întrerup" mesajul ce urmează a fi tradus) - o serie de elemente de reglaj ale transcripţiei:
. promotori,
. întăritori {,#nhancers,\'r)
. elemente proximale ale promotorilor
. atenuatori.
Promotorul este secvenţa care dirijează fixarea ARN-polimerazei la începutul genei care urmează să fie transcrisă. De aici începe sinteza ARN-ului mesager. Promotorul cel mai frecvent, denumit TA TA-box, este plasat la începutul genelor care trebuie transcrise eficient şi are următoarea secvenţă-consens:
Pentru varianta sa mai "degenerată", denumită "iniţiator", începerea transcrierii este mai puţin rapidă. Secvenţa-consens a unui iniţiator ar fi de forma:
PyPyANT($auA)PyPy,
în care Py este o pirimidină (nucleotid constituit dintr-o bază azotată conţinând un singur ciclu: C sau T), iar N este oricare nucleotid (poate fi o pirimidină, sau o purină - nucleotid constituit dintr-o bază azotată conţinând două cicluri: G sau A).
Există gene fără TATA-box sau iniţiator. In acest caz, transcrierea este lentă Ea începe din puncte multiple, în general în zona unde se află, în această ordine, nucleotidele C şi G. Despre acest "pas", cu proprietăţi fizice deosebite, cunoscut sub numele de "CpGstep" vom mai pomeni într-unui dintre capitolele următoare:
S\'-CpG-J\'
Litera "p" dintre simbolurile celor două nucleotide se utilizează, în mod tradiţional, pentru a reaminti că cele două elemente de secvenţă sunt unite printr-un residu fosfat, care leagă carbonul 3\' al dezoxiribozei citozinei de carbonul 5\' al dezoxiribozei guaninei, iar indicii 5\' şi 3\' (se citeşte 5-prim, 3-prim) indică ,.polaritatea" secvenţei (revezi Fig. 4.3).
Rolul proteinelor în semnalizare
Sistemul de semnalizare asigură reacţia promptă a celulei la factorii externi, care se manifestează prin prezenţa unui Jigond\'. Reacţia poate fi de scurtă durată, de ordinul a câtorva milisecunde, sau poate dura zile în şir. Noi vom discuta un astfel de caz în Partea a Hl-a. Semnalizarea poate fî fxiracrină, autocrină sau endocrină, după cum ligandul e furnizat de celulele vecine, de celula în cauză, în buclă de feed-back, sau provine de la distanţă, pe cale circulatorie, de la celule specializate.
Receptorii
Se numeşte receptor o macromoleculă (de regulă o proteină) prezentă în membrana celulară, în nucleu, sau în citoplasmă, capabilă să interacţioneze în mod specific cu o moleculă de ligand (adesea cu un hormon), drept care receptorul devine "activaf\'. Rolul receptorului activat este de a reacţiona Ia "mesajul" adus de ligand fie în mod direct (afectând nemijlocit comportamentul celulei), fie în mod indirect, acţionînd la rândul său asupra unui "mesager secundar".
In Fig. 4.11 sunt reprezente mai multe tipuri de receptori. începem cu câteva cazuri mai simple:
- receptori de tip ,Łanal ionic" (1). De exemplu, receptorul de acetil colină este un ansamblu de cinci sub-unităţi proteice. Fixarea acetilcolinei (a ligandului) la una dintre ele induce o schimbare de conformaţie de pe urma căreia se crează un canal prin care pot trece, în sensuri opuse, ionii de sodiu (dinspre spaţiul extracelular) şi de potasiu (dinspre spaţiul intracelular), provocând, de pildă, propagarea influxului nervos. E vorba de o reacţie care durează câteva fracţiuni de secundă. Pentru ligandul glutamat, ionii care se schimbă între ei sunt calciul şi sodiul.
- receptori de tip sleroidian (2). Aceştia constituie o familie variată, căci pot fi membranari, nucleari sau citoplasmici. Complexarea ligandului (care este o moleculă derivată din colesterol - cortisol, testosteron, etc.) înlătură o proteină-inhibitor şi induce o schimbare de conformaţie a receptorului, care-i permite să migreze spre nucleu, să recunoască, să interacţioneze cu ADN-ul şi să lanseze transcrierea anumitor gene. Rolul acestor receptori este important în cazul tumorilor hormonodependente.
- receptorii mediatori de endocitoză (3). Este cazul colesterolului trasportat sub formă de complex LDL (Jow desity lîpoproteiri"), care este internai izat în celulă după fixarea pe astfel de receptori. Colesterolul va servi apoi la sinteza altor steroizi.
Următoarele două categorii de receptori au o structură şi funcţionare mai complexă:
- receptorii asociaţi cu vproteinele-Gr\' (G. de la molecula de GTP, guanosin-trifosfat), (4). Ligandul (de exemplu adrenalina sau noradrenaima) se fixează de receptorul R, constituit dintr-un mănunchi de şapte a-helixuri proteice transmembranare. Proteina-G (constituită din mai multe subunităţi) "pluteşte" (difuzează) în membrană şi poate acum interacţiona cu helixurile 5 şi 6 ale receptorului.
In continuare, o moleculă de GTP poate să înlocuiască molecula de GDP rămasă ataşată la proteina-G după ciclul precedent ceea ce duce la disocierea complexului de subunităţi. Una dintre aceste subunităţi, cea rămasă legată la GTP, interacţionează la rândul său cu o enzimă-efector (care nu e ilustrată în figură), care generează un mesager secundar. In urma interacţiunii cu enzima-efector, molecula de GTP este hidrolizală la GDP şi fosfat complexul
proteinei-G este reconstituit şi ciclul se poate repeta. In cazul hormonilor "spaimei", menţionaţi mai sus, enzima-efector se numeşte adenilat-ciclază, iar mesagerul secundar este AMP-ul ciclic (cAMP).
- receptorii asociaţi cu tirozin-kinaza (5) (JtTIC - receptor tyrosine kinase" -de exemplu, cel pentru insulina, IGF, sau cel pentru factorul de creştere al epidermei, EGF) sau receptorii asociaţi cu serina-treonin-kinaza (6) (de exemplu, cel pentru factorul de creştere transformant p, TGFfi- în cazul acestor receptori, seria de aminoacizi tyr-tyr-tyr-tyr-tyr va fi înlocuită prin ser-thr-ser-thr-ser). Prezenţa ligandului induce dimerizarea a doi receptori de acelaşi fel, după care aceştia se auto-fosforilează la nivelul celor cinci tirozine (sau, respectiv, Ia nivelul serinelor şi al treoninelor).
O proteină-substrat, purtătoare a unui domeniu denumit SH2 (conţinând aminoacizii S: serină, H: histidină. nereprezentat în figură) interacţionează cu receptorul activat, urmând a fi fosforilată la rândul său.
Aceasta devine astfel un mesager secundar. Există numeroase variaţii ale acestei scheme de bază.
în cazul insulinei, de pildă, care interacţionează cu receptorul său de tip RTK, proteina cu domeniu SH2 se numeşte ISRI (Jnsuim receptor substrate-F) şi activează, la rândul său, prin proteinele GRB2 şi Sos, în "cascadă", proteina Ras. Aceasta din urmă, conţinând un domeniu analog proteinei Src, despre care am mai pomenit, este şi ea un generator de mesager secundar.
Proteina HER2 (sau c-ErbB-2), despre care voi vorbi în partea III este şi ea un receptor de tip RTK, asociat cu o tirozin-kinază.
Mesagerii secundari |
sus |
Mesagerii secundari transmit, în principiu, "mesajul" venit dinspre membrană către interiorul celulei. Sistemul adenilat-ciclazei, al protein-kinazei C (denumit şi sistemul inositol-lipidă), al calciului-cal-modulinei şi sistemul Ras sunt cele mai cunoscute cazuri de generatori de mesageri secundari. Să privim spre unii dintre ei.
Proteina Ras este în acelaşi timp o proteină-G şi o tirozin-kinază.
Ea transduce semnale provenind de la numeroşi receptori de tip RTK, iar
efectul produs depinde de tipul de receptor, de ligand şi de alte
circumstanţe. Exemplul insulinei ca ligand este doar unul dintre
numeroasele exemple posibile.
în linii mari, proteina Ras funcţionează în următoarele etape:
- Un hormon activează receptorul membranar (proteina RTK). O moleculă "adaptator", care se fixează la receptorul activat, poate fixa în continuare o altă moleculă, GEF (.guanine nucleotide-exchangefactor"), al cărei rol este acela de a se fixa pe proteina Ras, determinând-o să-şi abandoneze molecula de GDP în schimbul uneia de GTP şi să devină activă. în continuare, Ras activează o cascadă de protein-kinaze (Raf, Mek) care, în final, activează MAP-kmaza (MAP: jnitogen-activated proteirC).
Aceasta fbsforilează alte kinaze şi proteine citosolice, dar şi factori de transcriere, care pot declanşa exprimarea unor gene. Dezactivarea proteinei Ras are loc în urma interacţiunii cu o proteină GAP ("GTPase activating protein") prin hidro/iza moleculei de GTP, care o menţinuse activă.
Rolul cancerigen al oncoproteinei Ras rezidă tocmai în posibilitatea de a lansa transcrierea unor gene. Proteina Ras normală, a cărei activitate nu scapă de sub control, este esenţială, de pildă, diferenţierii celulelor în timpul embriogenezei. Mutantele oncogenice ale proteinei Ras sunt incapabile, în general, de a hidroliza GTP-ul, ceea ce înseamnă că sunt în stare activată în permanenţă. Rezultatul este că celulele vor fi împinse spre proliferare, favorizând procesul de cancerogeneză.
Cu titlu de curiozitate menţionez faptul că toxina holerei catalizează ADP-riboziJarea unei proteine-G din intestin, care ia rândul ei, via adenilat-ciclaza şi AMP ciclic este răspunzătoare de controlul excreţiei apei şi a sodiului. Proteina-G ribozilată, la fel ca şi în cazul proteinei Ras mutante, este incapabilă de a hidroliza GTP-ul şi rămâne activată permanent Urmarea este că individul va pierde în câteva ore aproape toată apa din organism.
Protein-kinaza C
Calea protein-kinazei C începe prin fixarea ligandului (de exemplu, a vasopresinei, responsabilă de controlul tensiunii arteriale) la un receptor mermbranar (din categoria celor conţinând şapte a-helixuri) urmată de activarea unei proteine-G. Proteina-G activează la rândul său fosfolipaza-C (PLC), care clivează o moleculă de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) în două fragmente, IP3 şi DAG, care devin, fiecare în parte, mesageri secundari.
IP3 (inositol 1,4,5-trifosfat) vizează receptorii canalelor de calciu din reticulul endoplasmic, care degajă calciul, cu rol de mesager secundar citosolic implicat într-o serie de procese, inclusiv sinteza ADN-ului.
DAG (diacilglicerol), pe de altă parte, activează protein-kinaza C. Aceasta din urmă fosforilează multe proteine-substrat, activând, între altele şi calea care duce spre intrarea în acţiune a promotorilor de gene conţinând secvenţa TRE, despre care vom mai vorbi.
Unii agenţi cancerigeni (din familia mitogenilor, care "promovează" cancerul, fără să-1 "inducă", de exemplu esterii de forbol) se servesc tocmai de simimlitudinea lor cu DAG pentru a activa protein-kinaza C şi a influenţa transcrierea ADN-ului.
AMP-ul ciclic
Am văzut mai sus cum adenilat-ciclaza este activată de către o proteină-G. AMP-ul ciclic produs de adenilat-ciclaza se fixează pe o protein-kinaza, care îşi "abandonează" în citosol domeniul catalitic. Acesta devine mesager secundar şi migrează din citoplasmă în nucleu, fosforilând un număr de proteine. Printre acestea se numără CREB ("cyclic AMP-binding protem"). Proteina CREB fosforilată este un factor de transcriere care recunoaşte promotorii de gene purtând secvenţa "CRE". Vom mai vorbi şi despre această secvenţă.
Calea AMP-ului ciclic controlează, în general, gene "cuminţi", de pildă cele implicate în gluconeogeneză. Partea interesantă este că secvenţa CRE (la care se ajunge pe calea AMP-ului ciclic) diferă printr-o singură nucleotidă de secvenţa TRE (la care se ajunge pe calea protein-kinazei C, stimulată şi de factori cancerigeni)!
Mai mult decât atât, secvenţa CRE poate fixa şi alţi factori de transcripţie, în afară de CREB, de exemplu homodimerul Jun-Jun. Dar excesul de Jun poate duce la formarea de hetero-dimeri de tipul Jun-Fos, care recunosc secvenţa TRE! In consecinţa, dacă, dintr-un motiv oarecare,secvenţe/e CRE nu sunt disponibile legării lui Jun, această proteină devine oncogenică, pentru că formeză dimerul Jun-Fos, care atacă TRE. Şi despre acest aspect vom mai pomeni.
Rolul sistemului imunitar |
sus |
Rolul sistemului imunitar este acela de a recunoaşte tot ceea ce este "străin" de corp, denumit ontigen. Sistemul imunitar este caracterizat prin diversitate, tolerantă, specificitate şi, mai cu seamă, memorie - dar aici nu vom intra în alte detalii legate de aceste aspecte. Există două categorii de reacţii imunitare:
- reacţie "umorală", care este mediată de anticorpi. Anticorpii sunt fabricaţi şi lansaţi în circulaţie de către celulele de tip B (B, de la ,Jbone\'\\ os în engleză - este vorba de limfocitele ai căror precursori se află şi rămân în măduva osoasă). Anticorpii (denumiţi şi imunoglobuline) se fixează pe antigenii pe care îi întâlnesc în cale, care pot fi fragmente de (macro)molecule, macromolecufe întregi, sau chiar bacterii şi viruşi întregi, iar ansamblul anticorp-antigen este dirijat apoi spre distrugere.
- reacţie imunitară mediată de celulele T (T, de la glanda timus, unde această categorie de limfocite, odată produse în măduva osoasă, migrează pentru maturizare - nu intrăm aici în detaliile privind rolul complexului major de histocompatibilitate, care se asigură de faptul că celulele şi moleculele proprii organismului nu vor fi considerate drept "străine").
Limfocitele de tip T intervin în două tipuri de acţiuni. în primul rând limfocitele T citotoxice (Tc, Jaller") ataca şi distrug ele însele celulele indesirabile, purtătoare de antigeni, impunând acestora să-şi lanseze propria apoptoză. în al doilea rând, limfocitele 7 ajutătoare (TH, ,Mlper") secretă limfokine (de exemplu interleukinele) adresate limfbcitelor B sau limfocitelor T citotoxice, spre a le indica prezenţa antigeniior şi a le stimula să intre în acţiune (trecem sub tăcere aici rolul macro/agi/or).
Febra şi starea de somnolenţă pe care le resimţim în momentele de boală se datorează secretarii în organism a interieukinelor - semn că sistemul imunitar este în alertă.
Stimularea sistemului imunitar cu ajutorul interieukinelor este una dintre căile prin care se încearcă să se amplifice reacţia organismului împotriva celulelor tumorale. Am mai spus că recunoaşterea celulelor canceroase de către sistemul imunitar este dificilă. S-au identificat, totuşi "limfocite infiltrante ale tumorilor", care au "recunoscut" celulele neoplazice, le-au atacat, dar s-au "împotmolit" la locul atacului. La institutul unde lucrez, prin administrare de interleukine, s-a reuşit mobilizarea acestor limfocite şi declanşarea unui răspuns imunitar masiv (în schimbul somnolenţei pacientului).
Atât limfocitele B, cât şi limfocitele T circulă în tot corpul prin reţeaua de vase sanghine şi prin cea de vase limfatice (Fig. 4.12), acumulându-se în amigdale, splină, sau nodulii limfatici. în clipa când celulele tumorale metastazează, ele vor circula prin aceleaşi căi. Primul loc de "popas" al celulelor metastazate sunt nodulii limfatici din apopiere. în cazul exerezei unei tumori, se îndepărtează întotdeauna şi nodulii limfatici din proximitate.
Mai remarcăm faptul că virusul Sidei atacă tocmai limfocitele de tip B. Limfocitele infectate se retrag în nodulii limfatici unde pot petrece ani de zile înainte ca efectul virusului să se manifesteze. In cele din urmă limfocitele B vor fi distruse, compromiţând funcţionarea sistemului imunitar al organismului.
***
Cu acestea am încheiat trecerea în revistă a principalelor mecanisme moleculare "ale viefii", inclusiv ale celor de control al ciclului celular. Am intuit, deasemenea, multitudinea nivelelor la care o mică deficienţă în structura sau în concentrafia unei proteine poate produce efecte catastrofale, inclusiv la orientarea celulelor spre cancer.
Gene, proteine, ciclu celular
