Antigenele clasei I Antigenele HLA de clasa I sunt definite serologic cu seruri imune umane provenite in principal de la femei multipare si, intr-o masura mai mica, cu
anticorpi monoclonali. Ele sunt prezente cu densitati diferite in majoritatea tesuturilor organismului, inclusiv in celulele B, celulele T si trombocite, dar nu in hematiile mature. Celulele T CD8+ se cupleaza preferential cu moleculele MHC clasa I printr-un loc de legatura CD8 pe clasa I. Numarul specificitatilor definite serologic este mare si sistemul HLA este sistemul genetic cel mai polimorf cunoscut la om. Pentru antigenele HLA clasa I, in complexul HLA sunt recunoscuti trei loci clar definiti. Fiecare antigen de clasa I este format dintr-o subunitate |32-microglobulinica de 11,5-kDa si un lant greu de 44-kDa care poarta specificitatile antigenice (ura 306-2). Sunt cunoscute peste 80 de specificitati A si B definite serologic si 8 specificitati C. Antigenele complexului major sunt notate cu prefixul HLA, dar acesta poate fi omis cand contextul este clar. Numarul care urmeaza dupa desemnarea locusului este numele antigenului (de ex., HLA-A2). Antigenele HLA ale popoarelor africane, asiatice si din Oceania includ multe dintre antigenele gasite in mod obisnuit la persoanele cu ascendenta vest-europeana. Totusi, distributia antigenelor HLA este distincta la unele grupuri rasiale si poate servi ca marker antropologic in studiul tipurilor de migrare si al bolilor.
Antigenele din clasa II Regiunea HLA-D este separata de locii clasei I de pe bratul scurt al cromosomului 6 prin 1000 kilobaze ( ura 306-l). Aceasta regiune codifica
o serie de molecule de clasa II, fiecare constand dintr-un lant (3 de 29-kDa si un lant a de 34 kDa ( ura 306-2). Incompatibilitatea pentru aceasta regiune, privind in special antigenele DR, determina raspunsul proliferativ in vitro al limfocitelor la haplotipuri nepotrivite, diferite. Celulele T CD4+ se leaga preferential de moleculele MHC clasa II printr-un loc de legatura CD4 al clasei II. Deoarece cromozomii sunt perechi, fiecare individ are 12 antigene HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DQ si HLA-DP, cate 6 de la fiecare parinte. Fiecare dintre aceste seturi cromozomiale este denumit haplotip si printr-o simpla transmitere mendeliana un sfert dintre descendenti au haplotipuri identice, jumatate au un haplotip identic si sfertul care ramane sunt complet incompatibili (ura 306-3). O doda ca acest complex de gene joaca un rol major in raspunsul la transt vine de la faptul ca o combinatie de descendenti donator-receptor compatibila prin haplotip da in trantul renal rezultate excelente, in jurul lorii de 85 -90% supravietuire pe termen lung ( modulul 272).
Raspunsul limfocitar mixt (MLR) este eluat prin gradul de proliferare a unei culturi mixte limfocitare (MLC) si este pozitiv chiar cand antigenele HLA-A, HLA-B si HLA-C sunt identice ( ura 306-3). Cand la parinti au avut loc recombinari intre HLA-B si DR, de exemplu, la copil apare un nou haplotip care fi identic pentru clasa I dar diferit pentru clasa II (un anti ar in ura 306-3). Antigenele HLA-D sunt definite prin stimulare cu limfocite de referinta, care sunt homozigote pentru HLA-D si sunt inactite prin iradiere cu raze X sau prin mitomicina C, facand reactia unidirectionala. Sunt peste 35 de astfel de antigene recunoscute de celulele homozigote de tipaj.Incercarile de definire a HLA-D prin serologie au silit intai o serie de antigene inrudite cu D (DR) exprimate pe moleculele de clasa II de pe limfocitele B, monocite si limfocitele T actite. Macrofagele, celulele dendritice si celulele Lan-gerhans tegumentare sunt de asemenea pozitive pentru clasa II. 22 de antigene DR, 8 DQ si 8 DP sunt recunoscute serologic. Harta genelor de clasa II aratata in ura 306-l descrie un numar minim de gene si seturi moleculare. Desi molecula de clasa II poate fi compusa din DQa (gena DQA1) din haplotipul unui parinte si din DQ|3 (gena DQB1) de la celalalt parinte (transcomplementare), combinatiile a si (3 intre seturile DP, DQ si DR survin rareori sau niciodata. Moleculele DR si, intr-o oarecare masura cele DQ, furnizeaza stimuli pentru MRL primar. Un al doilea tur al stimularii MLR in cultura (MLR secundar) este denumit test limfocitar amorsat (primed lymphocyte test - PLT) si se realizeaza rapid in 24-36 ore, in loc de 6-7 zile. Alloantigenele DP au fost descoperite ca urmare a capacitatii lor de a determina stimularea PLT, desi ele nu contribuie prea mult la MLR primar. Moleculele DQ si DP pot fi identificate, de asemenea, serologic. in timp ce limfocitele B si limfocitele T actite exprima toate cele trei seturi de molecule de clasa II, antigenele DQ nu sunt exprimate pe 60-90% dintre monocite ce sunt virtual toate DP si DR pozitive.
Structura tridimensionala a HLA Studiile de difractie in raze X ale moleculelor HLA clasa I cristalizate arata un sant sau despicatura pe suprafata indepartata fata de membrana celulara, cu dimensiuni suficiente pentru a lega un fragment peptidic linear, extins, lung de 8-l5 aminoacizi. De fapt, moleculele de clasa I leaga de obicei secvente de 9 aminoacizi. Marginile zonei de legatura sunt formate din spirale a si baza ei este formata din opt filamente antiparalele (3, cu domeniile al si a2 participand egal la fiecare parte a structurii (ura 306-4). Regiunile riabile HLA, care sunt recunoscute de alloanticorpi sau de celulele T citotoxice, se intind de-a lungul suprafetelor spiralelor a si a filamentelor |3 care formeaza marginile santului. Cand materialele legate, eliberate prin acidifierea cristalelor HLA clasa I purificate prin afinitate sau redizolte, au fost analizate prin cromatografie in mediu lichid de inalta performanta (HPLC), au fost gasite sute de peptide diferite. Dintre acelea care au fost analizate ulterior s-a evidentiat ca fiind caracteristica o secventa de 9 aminoacizi si o zona de legatura in pozitiile 2 si 9. Structura miezului moleculei heterodimerice al clasei II este foarte asemanatoare celei a clasei I. Organizarea atomilor de carbon ai aminoacizilor spiralelor a si ai filamentelor |3 ale clasei II este superpozabila celei de la clasa I. Prin urmare, forma si marimea globala a santurilor de legare sunt aceleasi si regiunile polimorfice ale clasei II sunt de asemenea ordonate de-a lungul marginilor spiralelor a si benzilor |3. Diferenta principala este aceea ca marginile santului clasei II sunt mai deschise, permitand legarea unor peptide lungi de pana la 26 aminoacizi.
Prelucrarea antigenului Receptorii limfocitului T leaga eficient numai fragmentele peptidice ale proteinelor prezentate in santul moleculei MHC seif. De fapt, toate moleculele MHC ajung la suprafata celulei cu un peptid in sant. Aceste peptide pot proveni dintr-o sursa intracelulara sau extracelulara. in cazul clasei I, calea este in mod primar una de selectie a peptidelor generate din proteinele endogene in timentul citosolic (de ex., din
infectiile virale intracelulare); pentru clasa II, calea este in mod primar una exogena, care prelucreaza proteinele ce au suferit endocitoza sau pinocitoza. Orice celula care exprima MHC clasa II poate servi ca celula prezentatoare de antigen (APC) limfocitelor CD4+; in plus, macrofagele pot de asemenea prelucra proteine exogene pe calea clasei I, pentru ale prezenta limfocitelor CD8+, oferind astfel mijlocul de actire a ambelor subseturi, CD4+ si CD8+, de fragmente ale aceluiasi antigen.
Proteinele citosolice supuse proteolizei includ constituentii celulari normali, inclusiv moleculele peptidului seif + MHC si agresorii straini, cum sunt virusurile. Genele proteozomilor cartografiate in regiunea clasei II a MHC (ura 306-l) codifica structurile citosolice care fragmenteaza proteinele in peptide scurte (8-9 aminoacizi); totusi, aceste gene particulare (LMP2 si LMP7) nu justifica prezenta tuturor peptidelor imunogenice formate in citosol. Un canal heterodimeric, codificat de genele TAP1 si TAP2, transporta apoi peptidele spre reticulul endoplas-matic (ER), unde legarea de lanturile grele ale clasei I si asocierea cu |32-microglobulina completeaza ansamblul clasei I inaintea transportului la suprafata celulei. Calea clasei II foloseste proteazele din culele acide endocitare pentru a produce o proteoliza intamplatoare a proteinelor ingerate. Endozomul bogat in peptide fuzioneaza apoi cu ER, unde se formeaza ansamblul clasei II. Peptidele cu o lungime de 13-26 aminoacizi eluate de pe moleculele clasei II deseori constau din secvente de lungimi riabile care au o regiune de legare acceptata in jur de 9 aminoacizi si cozi de marimi riate la oricare dintre capetele santului. Peptidele legate, de clasa II, eluate contin de asemenea o proportie mare de fragmente ale seif MHC.
Structura cristalina integrala a lanturilor oc si P ale TCR este necesara intelegerii topografiei exacte a legaturii TCR cu peptidul MHC +; totusi, analiza secventei genelor TCR indica trei regiuni hiperriabile (CDR) pentru fiecare lant. Un model probabil este cel in care regiunile CDR-l si CDR-2 ale lantului a al TCR se leaga de una dintre spiralele a ale MHC, in timp ce CDR-urile analoage ale lantului |3 al TCR se leaga de cealalta spirala a a MHC. Ambele regiuni CDR-3 ar fi, dupa acest model, in contact cu peptidele. Ca o alternati, este posibil ca toate aceste puncte de contact sa se realizeze cu portiuni ale spiralelor a ale MHC, a caror forma este modificata de peptid.
Genetica moleculara Fiecare lant polipeptidic al moleculelor din clasa I si clasa II poarta mai multe situsuri polimorfe. Antigenul "particular\" (de ex., B27 sau B35), definit prin alloantiseruri, depinde frecvent de mai mult decat de un situs pe fata moleculei. in testul de limfoliza mediata celular (CML) specificitatea celulelor T killer (Tc), care apar in timpul evenimentelor proliferative in MLR, este determinata de testarea pe celulele tinta de la donatori, altii decat cei care asigura stimulul pentru MRL. Sistemele antigenice definite prin aceasta metoda arata o corelare stransa, dar imperfecta, cu antigenele personale clasa I. Clonarea celulelor citotoxice a evidentiat prezenta unei rietati de determinanti tinta polimorfici pe molecule HLA, dintre care unii pot fi identificati cu alloantiseruri sau anticorpi monoclonali obtinuti prin imunizarea soarecelui cu celule umane. Unii dintre acesti reactivi pot fi folositi pentru identificarea determinantilor priti ai HLA, in timp ce altii sunt indreptati spre determinanti mai "publici\" (uneori numiti supertipici). Acestia din urma sunt epitopi gasiti identici pe moleculele care au specificitati prite diferite. Un astfel de sistem de antigene publice, HLA-B, are doua alele, Bw4 si Bw6. Mai mult, antigenele personale HLA-B sunt asociate fie cu Bw4, fie Bw6. HLA-B care poarta lanturi grele are situsuri aditionale care sunt comune lui B7, B27, B22 si B40 si altele comune cu B5, B15, B18 si B35. Exista si alte tipuri de determinanti antigenici comuni, fapt exemplificat de un anticorp monoclonal care reactioneaza cu un situs impartit intre lanturile grele HLA-A si HLA-B. Din ce in ce mai mult aceste complexitati sunt mai usor rezolte prin analiza secventelor DNA decat prin serologie.
Cand a fost examinat ADN genomic al HLA, au fost gasite secvente tipice exon-intron pentru ADN clasa I si clasa II, exonii gasindu-se pentru peptidele semnal (5\'), pentru fiecare dintre domenii, pentru segmentul transmembranar hidrofobic si pentru segmentul citoplasmatic (3\')- Probele ADNc sunt disponibile pentru majoritatea lanturilor HLA si au fost folosite produsele de
digestie enzimatica pentru studierea modelelor polimorfismelor lungimii fragmentului de restrictie (restriction
fragment lengthpolymorphisms-RFW), dintre care multe se coreleaza cu tiparele serologice si MRL ale clasei II. Totusi, sunt 20-30 gene clasa I ce fac dificila silirea polimorfismului prin RFLP. Multe dintre aceste gene nu sunt exprimate (pseudo-gene), in timp ce unele ar putea reprezenta loci clasa I aditionali care sunt exprimati numai pe celulele T actite si a caror functie nu este sigura. Tipizarea tesuturilor prin detectarea secventelor riabile de nucleotide incepe cu tehnica reactiei de polimerizare in lant (polymerase chain reaction-PCR) pentru a amplifica segmentele specifice de ADN, cum au fost definite de oligonucleotidele de amorsare din ADN genomic obtinut din probe mici de sange sau tesuturi. Elementele de amorsare sunt de obicei specifice pentru locus (de ex., lantul (31 al HLA-DR) sau pot fi specifice pentru alela (de ex., amplificand numai genele ce au o secventa polimorfica particulara). Produsele sunt apoi analizate prin hibridare cu probe marcate, specifice secventei, sau prin analiza RFLP a ADN amplificat. Tehnica a demonstrat deja capacitatea de identificare de secvente in populatia umana intr-un mod mai precis tehnicilor serologice silite. Nomenclatura oficiala HLA s-a schimbat, pentru a reflecta definirea secventelor distincte si pentru a documenta prezenta polimorfismelor neapreciate anterior de definirea prin serologia clasica. Pentru a ilustra, HLA-DR1 este scris ca DRBl*0101. DRB1 indica lantul (31 al locusului DR si *0101 arata ca este antigenul 1, prima rianta. In mod similar, DQAl*0302 indica lantul al al locusului DQ, antigenul 3, rianta 2. Multe obsertii recente asupra asocierilor bolilor cu antigenele HLA folosesc aceasta nomenclatura mai precisa ca sa defineasca baza moleculara pentru legarea peptidelor, ca si pentru a defini mai bine markeri genetici pentru diversitatea etnica si populationala. Tipizarea moleculara pentru HLA-DR este dovedita a avea loare in tipizarea clinica pentru transtul de organ si de madu osoasa.
Complementul (Clasa III) Genele structurale pentru cele trei componente ale complementului, C4, C2 si Bf (factor B), sunt prezente in regiunea HLA-BD ( ura 306-l). Sunt doi loci pentru C4, codificand pentru C4A si C4B, mai inainte recunoscute ca antigenele eritrocitelor ale lui Rodgers si, respectiv, ale lui Chido. Aceste antigene sunt de fapt molecule C4 plasmatice adsorbite. Alte componente ale complementului nu sunt strans legate de HLA. Nu s-au gasit incrucisari intre locii C2, Bf si C4. Ei sunt toti codificati intr-un segment de 100 kilobaze intre HLA-B si HLA-DR. Sunt doua alele pentru C2, patru pentru Bf, sapte pentru C4A si trei pentru C4B, plus spatiile libere (gene nule) pentru fiecare locus (QO). Polimorfismul extensiv al tipurilor de complement (complo-tipuri) le face utile pentru studiile genetice. Cele mai extinse patru haplotipuri gasite la stramosii populatiei vesteuropene se obser in elul 306-l. Aceste haplotipuri identice extinse pot fi conserte de la un stramos comun. MLR-urile intre indivizi neinruditi, care sunt potrivite pentru aceste haplotipuri extinse, sunt areactive, in timp ce o anume reactivitate este comuna daca indivizi neinruditi sunt serologic corespunzatori numai pentru antigenele HLA-DR.
Alte gene legate de cromozomul al saselea Deficienta de 21-hidroxilaza a steroizilor, o caracterisica autosomala recesi, determina sindromul hiperplaziei suprarenaliene congenitale ( modulele 332 si 339). Genele pentru enzima sunt de asemenea localizate si in regiunea HLA-B-D. Gena 21-hidroxilazei, vecina cu cea pentru C4A, este absenta la indivizii afectati si impreuna cu C4A (C4AQO) si locusul genei HLA-B pot sa fi fost modificate pentru a converti B13 in forma rar intalnita B47, gasita numai la haplotipurile afectate. Varianta cu debut tardiv a deficientei de 21-hidroxilaza este de asemenea legata de HLA. Hiperplazia suprarenaliana congenitala datorata deficientei de ll|3-hidroxilaza nu este legata de HLA. Hemocromatoza idiopatica, o tulburare autosomala recesi, este legata de HLA, asa cum s-a aratat in mai multe studii familiale ( modulul342). Desi patogenia acestei boli este necunoscuta, gena care moduleaza absorbtia intestinala a fierului este in apropiere de HLA-A (elul 306-2).
Genele raspunsului imun Asa cum s-a definit la inceput la cobai si la soarece, reactivitatea imuna inalta si scazuta la haptene sau peptide sintetice s-a dovedit a fi determinata de gene din regiunea MHC. Acum este clar ca aceste gene codifica moleculele de clasa II si ca proprietatea de a lega antigenul relent este determinantul major al unui raspuns puternic dependent de celula T, initiat de cate celulele T CD4+. Genele clasei I sunt de asemenea importante in fazele efectoare ale raspunsului, in special cu privire la recunoasterea de catre celulele T CD8+ a peptidului strain legat de moleculele de clasai. De exemplu, liniile celulare umane infectate cu virusul gripal sunt lizate de celulele T citotoxice imune (Tc) numai daca antigenul de clasa I (HLA-A sau HLA-B) este comun celulelor atacatoare si celor tinta. Moleculele claselor I si II sunt considerate a fi elemente de restrictie ale reactivitatii imune, pentru ca trebuie sa fie capabile sa lege si sa prezinte in mod corespunzator fragmentele peptidice catre celulele T. in raspunsul alogenic sunt do ca recunoasterea poate fi fie a diferentelor de aminoacizi de pe fata externa a moleculei MHC intacte, fie a unui fragment peptidic MHC prezentat de o rianta de molecula MHC reacti. in acest caz special, in loc de restrictio-narea raspunsului, diferentele antigenice ale MHC devin stimulatoare, in cazul transtului, fazele inductoare si efectoare ale respingerii urmeaza regulile generale ale TH (celula T helper) CD4+ si Tc CD8+ care interactioneaza cu MHC clasa II, respectiv clasa I (ura 306-5). Desi limfocitele B pot fi actite direct prin receptorii imunoglobulinici de pe suprafata lor, ele exprima de asemenea concentratii ridicate de molecule de clasa I si II si pot prelucra antigenele pentru a le prezenta pe suprafata celulei. Raspunsul celulei T la o astfel de prezentare a antigenului este cel care asigura "ajutorul\" cerut de catre celulele B pentru un raspuns matur al secretiei de Ig.
